H5N1 NS1 eIF4GI結(jié)合區(qū)缺失毒感染CEF蛋白質(zhì)組學(xué)及HNRNPK促流感病毒增殖的機(jī)制研究.pdf

1、禽流感病毒宿主范圍廣泛，不僅可以感染各種禽類，對(duì)家禽養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，偶爾也可感染人類，因其感染后引起的高死亡率而嚴(yán)重危害著人類的生命健康。流感病毒的生存嚴(yán)格依賴于宿主細(xì)胞，病毒的感染、復(fù)制、致病以及逃避宿主免疫離不開(kāi)與宿主各種蛋白發(fā)生相互作用。非結(jié)構(gòu)蛋白NS1是流感病毒的一個(gè)重要的毒力因子，它能夠通過(guò)多種策略逃避宿主免疫反應(yīng)而調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制。NS1蛋白的81-113位氨基酸能夠招募宿主蛋白真核翻譯起始因子4GI(eIF4GI)

2、到病毒mRNA5'端未翻譯區(qū)，優(yōu)先翻譯病毒mRNA，促進(jìn)病毒復(fù)制。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)NS1片段缺失eIF4GI結(jié)合區(qū)的重組H5N1禽流感病毒(rNS1-SD30)相對(duì)于野生病毒(rNS1-wt)，在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中其毒力和致病性都顯著地降低，并且在MDCK細(xì)胞上抑制干擾素的能力也受到損傷。然而重組缺失毒rNS1-SD30感染引起的宿主蛋白變化，以及有那些宿主因子參與了毒力及其致病的降低的作用機(jī)制還不清楚。
　　不均一核糖核蛋白（

3、HNRNPs）家族蛋白的功能繁多，主要參與細(xì)胞中mRNA的剪接、轉(zhuǎn)錄、穩(wěn)定、翻譯和轉(zhuǎn)運(yùn)等的調(diào)節(jié)功能，一些蛋白還參與了宿主的免疫調(diào)節(jié)。近年來(lái)有關(guān)HNRNPs調(diào)控病毒復(fù)制的研究越來(lái)越多，通過(guò)調(diào)節(jié)病毒mRNA的剪接以及與病毒蛋白互作調(diào)節(jié)病毒復(fù)制，而HNRNPK參與了多個(gè)病毒的復(fù)制過(guò)程。HNRNPK直接與甲型流感病毒的M1mRNA結(jié)合促進(jìn)M1mRNA剪接產(chǎn)生M2mRNA，導(dǎo)致編碼產(chǎn)生的M2蛋白增多，進(jìn)而促進(jìn)流感病毒的復(fù)制。然而HNRNPK與流感

4、病毒蛋白的相互作用以及是否參與了宿主的天然免疫調(diào)節(jié)還不清楚。
　　本研究采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法研究了rNS1-wt及rNS1-SD30病毒感染雞胚成纖維(CEF)細(xì)胞后蛋白質(zhì)的差異表達(dá)情況，研究了差異表達(dá)蛋白ANXA7對(duì)病毒增值以及禽天然免疫調(diào)節(jié)的作用，還研究了人源HNRNPK與流感病毒的相互作用以及調(diào)控IFN產(chǎn)生的作用機(jī)制。本研究主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.rNS1-wt及rNS1-SD30病毒感染CEF的蛋白質(zhì)組

5、學(xué)研究
　　rNS1-wt及rNS1-SD30病毒感染CEF12h，24h和36h后運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定到81個(gè)差異表達(dá)宿主蛋白，對(duì)鑒定到的蛋白進(jìn)行功能分類分析，發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白主要參與了細(xì)胞骨架的形成、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、mRNA加工剪切、運(yùn)輸和代謝以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等進(jìn)程。進(jìn)而克隆表達(dá)部分基因并研究其對(duì)病毒復(fù)制的影響，發(fā)現(xiàn)ANXA7抑制rNS1-SD30在DF1細(xì)胞的增殖，而對(duì)rNS1-wt并沒(méi)有影響。
　　2.ANXA7

6、通過(guò)調(diào)節(jié)MDA5的表達(dá)正調(diào)控雞RLR信號(hào)通路
　　構(gòu)建了雞RLR信號(hào)通路研究平臺(tái)，發(fā)現(xiàn)ANXA7、ALDH7A1及DCTN2等蛋白促進(jìn)MDA5誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ANXA7促進(jìn)rNS1-SD30刺激的IFN-β產(chǎn)生，而并不影響rNS1-wt誘導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生。ANXA7促進(jìn)polyI∶C及MDA5介導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生通過(guò)靶向MDA5并調(diào)節(jié)其蛋白表達(dá)，同時(shí)ANXA7與MDA5存在相互作用，其C端鈣離子磷脂結(jié)合區(qū)是促

7、進(jìn)IFN-β的關(guān)鍵區(qū)域。
　　3.人源HNRNPK通過(guò)與NS1蛋白互作促進(jìn)流感病毒增殖
　　流感病毒感染A549細(xì)胞下調(diào)HNRNPK的表達(dá)，同時(shí)過(guò)表達(dá)HNRNPK顯著促進(jìn)多個(gè)亞型流感病毒的增殖，沉默HNRNPK抑制病毒的增殖。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)HNRNPK與NS1存在RNA非依賴性的相互作用，NS1的N端RBD以及HNRNPK的RNA結(jié)合區(qū)KH2和蛋白-蛋白互作區(qū)KI是NS1與HNRNPK發(fā)生相互作用的關(guān)鍵區(qū)域。HNRNPK的RNA

8、結(jié)合區(qū)KH2和核穿梭區(qū)KNS是促進(jìn)流感病毒增殖的關(guān)鍵區(qū)域。
　　4.HNRNPK抑制IFN-β產(chǎn)生并參與到NS1逃避的天然免疫
　　研究發(fā)現(xiàn)HNRNPK抑制流感病毒和仙臺(tái)病毒(Sev)介導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生以及IRF3的磷酸化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HNRNPK與RIG-Ⅰ信號(hào)通路的TRAF3發(fā)生相互作用，HNRNPK的兩個(gè)RNA結(jié)合區(qū)KH1和KH2以及蛋白互作區(qū)KI和TRAF3的RING finger在TRAF3與HNRNPK的相互