不結(jié)球白菜雄蕊突變系及其保持系中BcERF-B3基因功能的研究.pdf

1、不結(jié)球白菜（Brassica campestris ssp.chinensis Makino），原產(chǎn)中國(guó)大陸，是我國(guó)人民，尤其是南方群眾喜食的主要蔬菜之一。近些年來(lái)，其產(chǎn)量和質(zhì)量需求不斷提高，但由于雄性不育品種較少且穩(wěn)定性較差，不能充分利用雜種優(yōu)勢(shì)來(lái)獲得優(yōu)良種質(zhì)，故獲得優(yōu)質(zhì)的雄性不育系成為如今十分迫切的任務(wù)之一。雄蕊花瓣化，可以徹底消除不育系自身花粉的影響，具有良好的科研利用價(jià)值。
　　本文在已獲得的不結(jié)球白菜中穩(wěn)定性較好的雄蕊瓣

2、化系及其保持系作為研究試驗(yàn)材料，測(cè)定了2種材料中的一些代謝生理指標(biāo)，用分子標(biāo)記法獲得2種材料的差異片段并克隆出差異基因BcERF-B3的ORF全長(zhǎng)，通過(guò)qRT-PCR的手段探究該基因在不同組織及器官中的表達(dá)，然后構(gòu)建其過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒，擬對(duì)該基因的功能進(jìn)行轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證。另外，通過(guò)原核表達(dá)得到該基因的誘導(dǎo)蛋白，為下一步探究該基因作用的下游基因奠定基礎(chǔ)。本文主要研究結(jié)果如下:
　　1.形態(tài)觀察及生理指標(biāo)的測(cè)定
　　本研究以實(shí)驗(yàn)室保存

3、的不結(jié)球白菜雄蕊突變系和保持系為試驗(yàn)材料，進(jìn)行花器官形態(tài)觀測(cè)，并對(duì)花發(fā)育不同時(shí)期中2種材料SOD、POD及CAT活性、可溶性蛋白、可溶性糖和MDA含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，與保持系中相比，突變系花器官中最明顯的不同處在于其雄蕊完全缺失，而花瓣的數(shù)目則相應(yīng)增加，雄蕊對(duì)應(yīng)處的花瓣無(wú)花藥，推斷本研究中該雄蕊突變系可能屬于花同源異型的突變類型;與保持系花發(fā)育過(guò)程中三種抗氧化酶活性和MDA含量相比，突變系在中后期顯著升高;在花發(fā)育不同時(shí)期中，突變系

4、的可溶性糖和可溶性蛋白含量低于保持系，且2者在發(fā)育中期存在顯著差異。
　　2.BcERF-B3基因的分子克隆及乙烯調(diào)控分析
　　通過(guò)RT-PCR技術(shù)克隆出不同不結(jié)球白菜中差異基因，即乙烯響應(yīng)因子（ERF）基因，命名為BcERF-B3，利用生物學(xué)軟件進(jìn)行序列分析。結(jié)果顯示，不結(jié)球白菜BcERF-B3基因的0RF全長(zhǎng)(807bp)，編碼268個(gè)氨基酸;RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，花期BcERF-B3基因在花瓣、雄蕊及花柱中表達(dá)量均顯著

5、高于保持系;實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)發(fā)現(xiàn)，BcERF-B3基因在突變系花發(fā)育中期表達(dá)量明顯升高，且蕾期噴施乙烯(ET)能促進(jìn)其表達(dá)，外施AgNO3抑制該基因表達(dá)。本研究表明BcERF-B3基因可能在花發(fā)育中期時(shí)響應(yīng)內(nèi)源ET而促進(jìn)了雄蕊的發(fā)育異常。
　　3.BcERF-B3基因在不結(jié)球白菜響應(yīng)脅迫中的表達(dá)及其過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
　　為詳細(xì)了解BcERF-B3基因在不結(jié)球白菜突變系和保持系中不同脅迫下的表達(dá)譜，分別取樣進(jìn)行q

6、PCR。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變系中BcERF-B3基因響應(yīng)ABA、MeJA和低溫脅迫，推測(cè)該基因可能受2種激素和低溫誘導(dǎo)，調(diào)控花器官的發(fā)育異常;利用Gateway技術(shù)手段，構(gòu)成35S∷BcERF-B3的過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化入根癌農(nóng)桿菌，為深入探索不結(jié)球白菜BcERF-B3基因的功能及作用機(jī)理，進(jìn)一步優(yōu)化不結(jié)球白菜雄性不育品系奠定基礎(chǔ)。
　　4.不結(jié)球白菜BcERF-B3基因原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及原核表達(dá)
　　將BcERF-B3 OR

7、F全長(zhǎng)片段定向插入原核表達(dá)載體pET30a中，并轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21(DE3)進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)，對(duì)誘導(dǎo)的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)濃度、溫度條件進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得目的蛋白，為下一步的驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明，pET30a-BcERF-B3成功導(dǎo)入宿主菌BL21(DE3)中;SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒表達(dá)出35.4KD的融合蛋白，與編碼蛋白大小為29.6KD的預(yù)測(cè)結(jié)果一致，但條帶較弱;對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化結(jié)果顯示，融合