手性合成芳基鄰二醇醛縮酶的基因挖掘和分子改造.pdf

1、手性芳基鄰二醇是一類重要的多官能團(tuán)化合物，常作為有機(jī)合成、制藥和精細(xì)化工等領(lǐng)域的關(guān)鍵手性砌塊之一。在現(xiàn)有的制備手段中，以醛縮酶為代表的生物催化不對(duì)稱合成方法具有立體選擇性好、反應(yīng)條件溫和且原子利用率高的天然優(yōu)勢，因此是手性芳基鄰二醇不對(duì)稱合成的優(yōu)選途徑。但多數(shù)醛縮酶的底物譜較窄，且對(duì)非天然底物的催化活力較低，難以滿足工業(yè)化應(yīng)用的需求?；谶@一現(xiàn)狀，本研究開展了包括基因挖掘和酶分子改造在內(nèi)的一系列研究，旨在開發(fā)具有高催化效率和高立體選擇性

2、的生物催化劑，用于手性芳基鄰二醇的不對(duì)稱制備。
　　首先利用基因挖掘的策略，對(duì)美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中不同來源的醛縮酶基因進(jìn)行克隆，并對(duì)重組蛋白的表達(dá)條件包括誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)長以及分子伴侶的共表達(dá)等，進(jìn)行了一系列的探索和優(yōu)化，最終實(shí)現(xiàn)了大部分重組蛋白的可溶性表達(dá)，從而完成相應(yīng)醛縮酶庫（包含25個(gè)醛縮酶）的構(gòu)建。在此基礎(chǔ)上，選取一系列醛類和酮類分別作為羥醛縮合反應(yīng)的受體和供體，對(duì)構(gòu)建的醛縮酶庫進(jìn)行篩選，最終獲得兩

3、株能夠催化肉桂醛與羥基丙酮(Hydroxyacetone，HA)發(fā)生羥醛縮合反應(yīng)的重組酶，即來源于E.coli K12的D-果糖-6-磷酸醛縮酶A(FSAA)和D-果糖-6-磷酸醛縮酶B(FSAB)。
　　在完成FSAA和FSAB表達(dá)條件的深度優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)二者的高效可溶性表達(dá)后，對(duì)二者進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)表征。相關(guān)結(jié)果顯示，F(xiàn)SAA和FSAB的最適反應(yīng)溫度分別為30℃和25℃，且FSAA能在較寬的溫度范圍內(nèi)(20～60℃)發(fā)生作用，熱穩(wěn)定性

4、明顯優(yōu)于FSAB。鑒于熱穩(wěn)定性是影響生物催化劑工業(yè)化應(yīng)用前景的重要因素之一，可以預(yù)見FSAA的工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值將大于FSAB，因此后續(xù)研究主要針對(duì)FSAA進(jìn)行展開。此外，在保證自發(fā)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率低于1％的前提下，F(xiàn)SAA在檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(100mM，pH6.5)中具備最佳催化效率;為提高肉桂醛溶解度而添加的助溶劑均會(huì)導(dǎo)致該酶催化效率的降低，因此后期反應(yīng)均不考慮添加任何助溶劑。
　　為了優(yōu)化FSAA對(duì)肉桂醛的催化活力，嘗試對(duì)該酶進(jìn)

5、行理性設(shè)計(jì)。首先采取減小空間位阻和引入分子間相互作用力的方式，對(duì)與底物間有直接相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行突變，但篩選結(jié)果顯示所構(gòu)建的突變體催化活力均未得到提高，表明上述策略并不適用于FSAA對(duì)肉桂醛催化性能的優(yōu)化。隨后對(duì)FSAA催化機(jī)理的分析顯示，在其催化過程中涉及到一個(gè)參與質(zhì)子傳遞的關(guān)鍵水分子，嘗試將與該水分子形成氫鍵作用的三個(gè)位點(diǎn)(Q59，T109和Y131)突變?yōu)樾再|(zhì)及結(jié)構(gòu)相似的氨基酸殘基，得到四個(gè)單點(diǎn)突變體(Q59N，Q59E，T1

6、09S和Y131F)。其中，突變體Q59N的活力達(dá)到了野生型的3倍。對(duì)59位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步突變，得到了活力分別達(dá)到野生型的23和25倍的兩個(gè)突變體Q59T和Q59L。相關(guān)分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果顯示，十聚體FSAA的每個(gè)亞基C-末端的最后一個(gè)α-螺旋(α-helix)均繞至臨近單體活性中心上方并與之產(chǎn)生界面相互作用，而59位點(diǎn)的改變會(huì)對(duì)該α-螺旋的走向產(chǎn)生一定的影響，進(jìn)而影響FSAA催化肉桂醛的活力:此外，59位點(diǎn)雖然不與底物直接接觸，但能通過

7、氨基酸殘基相互作用網(wǎng)(Residueinteraction network)對(duì)FSAA的活力產(chǎn)生間接影響。以上結(jié)果表明，在選擇突變位點(diǎn)進(jìn)行酶分子活力優(yōu)化時(shí)，除了考慮與底物具有直接相互作用的位點(diǎn)，對(duì)活性中心附近處于氨基酸殘基相互作用網(wǎng)中的位點(diǎn)進(jìn)行改造也能起到很好的效果。
　　考慮到FSAA是一個(gè)多亞基酶，且每個(gè)亞基C-末端的最后一個(gè)α-螺旋(α-helix)與臨近單體的活性中心間形成界面相互作用，本論文提出通過協(xié)同調(diào)控亞基內(nèi)和亞基間

8、相互作用的方式來優(yōu)化FSAA對(duì)噻吩類雜環(huán)芳香醛的催化性能。經(jīng)過一系列的突變篩選，最終獲得了一個(gè)組合突變體FSAAI31T/Q59T/I195Q，通過改造31位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)對(duì)亞基內(nèi)相互作用的調(diào)控，而對(duì)59位點(diǎn)和195位點(diǎn)的替換則用于調(diào)控亞基間相互作用，其對(duì)噻吩-2-甲醛、噻吩-3-甲醛、苯并噻吩-2-甲醛、糠醛和吡啶-2-甲醛的催化效率達(dá)到了野生型的27-278倍。利用此突變體作為全細(xì)胞催化劑能在較高底物濃度(350-500mM)下催化上述芳香