秘魯魷魚肌原纖維蛋白分離純化及相互作用研究.pdf

1、秘魯魷魚資源豐富，價(jià)格低廉，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是制作魚糜等肉制品的重要原料，但由于其凝膠性能較差，導(dǎo)致其加工產(chǎn)品不受消費(fèi)者喜愛(ài)。因此如何提高秘魯魷魚肌原纖維蛋白的凝膠性能，提高魚糜制品的品質(zhì)，是我們目前急需解決的問(wèn)題。而蛋白質(zhì)是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜、功能多樣的大分子，很多研究表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化將會(huì)導(dǎo)致其性能的變化，進(jìn)而影響產(chǎn)品品質(zhì)。因此本文從蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系為出發(fā)點(diǎn)，首先從復(fù)雜的肌原纖維混合蛋白體系中分離純化出高純度的單一蛋白，由繁入簡(jiǎn)，以期以

2、單一蛋白為研究模型，為以后進(jìn)一步考察單一蛋白結(jié)構(gòu)的變化與凝膠性能之間的關(guān)系做準(zhǔn)備，再由簡(jiǎn)入繁，以便更好地考察復(fù)雜蛋白體系下蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)凝膠性能的影響，以期為秘魯魷魚魚糜制品的加工生產(chǎn)提供科學(xué)的理論指導(dǎo)及依據(jù)。
　　本文重點(diǎn)是建立從秘魯魷魚肌原纖維蛋白中分離純化出高純度單一蛋白的方法策略，首先采用HiTrap Q FF16/10強(qiáng)陰離子柱進(jìn)行初步分離，再用SuperdexTM20010/300凝膠柱進(jìn)行進(jìn)一步分離，共得到四種單一蛋白

3、:副肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白和肌球蛋白輕鏈，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)其純度均達(dá)到了電泳純，經(jīng)HPLC鑒定副肌球蛋白純度為85％，肌動(dòng)蛋白為92％，原肌球蛋白為98％，肌球蛋白輕鏈為96％，并經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定成功。
　　在蛋白純化實(shí)驗(yàn)中對(duì)從離子柱收集到的蛋白液進(jìn)行超濾濃縮過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)流穿峰A及30％洗脫峰D所收集的蛋白液經(jīng)超濾濃縮處理后，溶液中出現(xiàn)很多形狀規(guī)則且均一的纖維絲狀小聚集體，由于聚集體的形成可能會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)

4、的分離純化產(chǎn)生一定影響，因此本論文對(duì)該聚集體的形成機(jī)制展開了討論研究。首先利用熒光顯微鏡、動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)對(duì)濃縮前后溶液中的蛋白的微觀結(jié)構(gòu)及粒徑進(jìn)行表征，證明纖維聚集體的形成是在超濾濃縮處理后才產(chǎn)生的。同時(shí)利用紫外光譜、熒光光譜及圓二色譜技術(shù)手段，從分子層面研究了濃縮前后蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的變化。結(jié)果表明:從離子柱收集到的蛋白液經(jīng)超濾濃縮處理后，蛋白分子形成纖維狀規(guī)則結(jié)構(gòu)、粒徑增加，且蛋白空間構(gòu)象發(fā)生變化，色氨酸及酪氨酸殘基更加暴露于溶劑中，

5、同時(shí)蛋白質(zhì)的α-螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)含量增加，蛋白結(jié)構(gòu)變得更加有序。初步猜測(cè)纖維聚集體的形成機(jī)制主要是由濃度效應(yīng)及剪切效應(yīng)共同驅(qū)動(dòng)形成，蛋白濃度增加，蛋白分子碰撞機(jī)率增加，驅(qū)使蛋白聚集;剪切效應(yīng)可能導(dǎo)致了蛋白空間構(gòu)象發(fā)生變化，氨基酸的暴露增加了蛋白質(zhì)間的疏水相互作用及氫鍵作用，同時(shí)也增加了蛋白與蛋白之間吸附的有效作用位點(diǎn)，使球形蛋白顆粒以特定的線性連接方式構(gòu)成棒狀結(jié)構(gòu)，每個(gè)棒狀結(jié)構(gòu)兩端可能均有特定作用位點(diǎn)，使短棒線性連接成長(zhǎng)棒，形成纖維絲聚集體

6、。并初步推測(cè)纖維絲聚集體是由副肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白形成。
　　由于肌原纖維蛋白分子在凝膠的形成過(guò)程中勢(shì)必會(huì)產(chǎn)生聚集體，而聚集體的形成則與蛋白分子間的相互作用力密切相關(guān)，同時(shí)凝膠形成的好壞與鹽濃度也存在很大關(guān)系。因此，本章以純化出的單一蛋白副肌球蛋白為模型，首先利用光散射技術(shù)對(duì)純化出的單一蛋白進(jìn)行粒徑及重均分子量的表征，再通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)在KCl鹽溶液中的滲透第二維里系數(shù)A2，考察副肌球蛋白在不同濃度KCl溶液中的相互作用力變化，為進(jìn)一