Ca2+-CaN-Cb1-b-Akt在缺血及藥物預(yù)處理中的作用研究.pdf

1、目的:
　　 缺血性腦損傷是主要的致死、致殘性疾病，為患者家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)，但至今尚無有效的治療策略來改善其預(yù)后。短暫的、亞致死性缺血預(yù)處理能使細(xì)胞和組織對隨后發(fā)生的長時間的致死性腦缺血損傷起到保護(hù)作用，這一現(xiàn)象被稱為缺血耐受。
　　 磷脂?；?-激酶PI3K/Akt信號通路在缺血預(yù)處理過程中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。Cbl-b屬于Cbl原癌基因家族成員之一。在T細(xì)胞中Cbl-b通過泛素化PI3K的P85亞基，負(fù)調(diào)控P

2、I3K/Akt信號通路，抑制T細(xì)胞的活化。Cbl-b對PI3K/Akt通路的負(fù)調(diào)控作用在T細(xì)胞、骨瘤細(xì)胞、B細(xì)胞、肥大細(xì)胞等多種細(xì)胞中都有發(fā)現(xiàn)。我們研究組先前的研究表明，在大鼠局灶性腦缺血模型中缺血耐受通過抑制Cbl-b、增加磷酸化Akt的表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。
　　 在T細(xì)胞內(nèi)鈣水平升高并與鈣調(diào)素結(jié)合，從而使鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(Calcineurin，CaN)活化，活化的CaN使轉(zhuǎn)錄因子NFAT脫磷酸化并轉(zhuǎn)移至

3、核內(nèi)，NFAT作為一種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)Cbl-b基因的表達(dá)。
　　 本研究利用PC12細(xì)胞系建立氧糖剝奪缺血耐受模型，觀察Ca2+/CaN/Cbl-b與PI3K/Akt在這一過程中的相互作用關(guān)系，研究氧糖剝奪預(yù)處理時它們在細(xì)胞凋亡中的作用和可能機(jī)制，并進(jìn)一步探討了尼莫地平、MK801等鈣離子拮抗劑在藥物預(yù)處理方面的作用。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1.采用氧糖剝奪方法建立細(xì)胞缺血及預(yù)處理模型。
　　 2.采用M

4、TT方法測定細(xì)胞生存率。
　　 3.采用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并采用Hoechst33258細(xì)胞核染色檢測凋亡細(xì)胞。
　　 4.采用Real time PCR方法半定量檢測泛素連接酶Cbl-b的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。
　　 5.采用Western blot方法檢測CaN、Cbl-b、p-Akt、 p-GSK3β、Caspase-3和Bcl-2蛋白的表達(dá)。
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:所有數(shù)據(jù)均為6-8次獨(dú)立

5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用SPSSI3.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.MTT方法檢測細(xì)胞生存率結(jié)果表明預(yù)處理降低缺血對PC12細(xì)胞的損傷:與正常對照組相比，缺血組生存率顯著降低(P＜0.05);與缺血組相比，預(yù)處理組細(xì)胞存活率升高(P＜0.05)。
　　 2.Real time PCR方法檢測Cbl-bmRNA結(jié)果表明預(yù)處理降低Cbl-b的轉(zhuǎn)錄:缺血組的Cbl-b轉(zhuǎn)錄水平高于

6、對照組，兩組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。預(yù)處理組的Cbl-b轉(zhuǎn)錄水平低于缺血組，兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。預(yù)處理前加入PI3K特異性抑制劑LY294002抑制Cbl-b轉(zhuǎn)錄的減低。
　　 3.Western blot方法檢測不同蛋白表達(dá)水平結(jié)果表明預(yù)處理通過CaN和Cbl-b調(diào)控PI3K/Akt通路，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用:缺血組CaN和Cbl-b表達(dá)增加，但p-Akt、p-GSK3β表達(dá)顯著減低;預(yù)處理顯

7、著抑制CaN和Cbl-b的表達(dá)，激活A(yù)kt和GSK3β;PI3K通路特異性抑制劑LY294002部分的抑制預(yù)處理后CaN和Cbl-b的減低，但顯著抑制Akt和GSK3β的激活。
　　 4.Western blot方法檢測不同蛋白表達(dá)水平結(jié)果表明預(yù)處理對CaN、Cbl-b和Akt激活時間不同:預(yù)處理早期(0-6 h) Cbl-b的表達(dá)逐漸增加，6h至峰值。之后隨著時間延長Cbl-b的表達(dá)逐漸減少，而p-Akt的表達(dá)持續(xù)增多。6h后

8、Cbl-b呈明顯下降趨勢，而p-Akt活性逐漸增強(qiáng)，兩者呈反向變化。CaN直接達(dá)峰，基本與Cbl-b伴行，呈同向變化。
　　 5.Western blot方法檢測不同蛋白表達(dá)水平結(jié)果表明預(yù)處理通過抑制凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用:預(yù)處理后細(xì)胞中Bel-2的表達(dá)顯著升高，而Caspase-3的表達(dá)顯著降低，抑制細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞存活率;PI3K通路特異性抑制劑LY294002顯著抑制Bcl-2的升高和Caspase-3表達(dá)的降低，抑制了預(yù)

9、處理的保護(hù)作用。
　　 6.Western blot方法檢測不同蛋白表達(dá)水平結(jié)果表明Ca2+參與缺血預(yù)處理的調(diào)控:缺血預(yù)處理顯著降低CaN和Cbl-b的表達(dá);而缺血預(yù)處理前加入鈣離子載體A23187抑制預(yù)處理引起的CaN和Cbl-b表達(dá)的降低，顯著減弱缺血預(yù)處理的保護(hù)作用。
　　 7.MTT方法檢測細(xì)胞生存率結(jié)果表明尼莫地平和MK801降低缺血對PC12細(xì)胞的損傷:尼莫地平或MK801藥物預(yù)處理的細(xì)胞生存率升高(與缺血組

10、比較p＜0.05)，顯著降低缺血對細(xì)胞的損傷，LY294002顯著降低尼莫地平和MK801的保護(hù)作用。
　　 8.Western blot方法檢測不同蛋白表達(dá)水平結(jié)果表明尼莫地平或MK801通過CaN和Cbl-b調(diào)控PI3K/Akt通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用:缺血組CaN和Cbl-b表達(dá)增加，但p-Akt、p-GSK3β表達(dá)顯著減低;尼莫地平或MK801顯著抑制CaN和Cbl-b的表達(dá)，激活A(yù)kt和GSK3β;PI3K通路特異性抑制劑

11、LY294002不影響尼莫地平或MK801處理后CaN和Cbl-b的表達(dá)，但顯著抑制Akt和GSK3β的激活。
　　 9.Western blot方法檢測不同蛋白表達(dá)水平結(jié)果表明尼莫地平或MK801通過抑制凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用:尼莫地平或MK801處理后細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)顯著升高，而Caspase-3的表達(dá)顯著降低，抑制細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞存活率;PI3K通路特異性抑制劑LY294002顯著抑制Bcl-2的升高，抑制了尼莫地平

12、和MK801的保護(hù)作用。
　　 結(jié)論:
　　 1.缺血組CaN、Cbl-b的表達(dá)增加，p-Akt/p-GSK的表達(dá)減少，減少抗凋亡蛋白Bcl-2、增加Caspase-3的表達(dá)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷，缺血預(yù)處理逆轉(zhuǎn)了這一過程而起到神經(jīng)保護(hù)作用。CaN可能是通過使轉(zhuǎn)錄因子NFAT脫磷酸化并轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，NFAT作為一種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)Cbl-b基因的表達(dá)，Cbl-b可能通過泛素化PI3K/Akt通路的p85調(diào)節(jié)亞基而起作用。
　　

13、 2.鈣離子載體A23187和環(huán)孢素A在缺血及預(yù)處理的過程中起到重要的調(diào)控作用，說明Ca2+濃度變化可能是預(yù)處理保護(hù)作用的啟動因素，同時也為Ca2+拮抗劑起到藥物預(yù)處理的保護(hù)作用提供了一定的依據(jù)。
　　 3.尼莫地平、MK801兩種不同類型的鈣離子拮抗劑均可減少CaN和Cbl-b的表達(dá)，進(jìn)而作用于生存通路PI3K/Akt/GSK信號通路調(diào)控促凋亡及抗凋亡蛋白之間的平衡，它們可能通過與缺血預(yù)處理相同或相似的一條或多條途徑發(fā)揮保護(hù)作