微流控技術在聯(lián)合應用FK506、NGF促進神經(jīng)再生研究中的應用.pdf

1、急性脊髓損傷（Acute Spinal Cord Injury，ASCI）是嚴重危害人類健康的一種疾病，隨著社會的不斷發(fā)展，其發(fā)病率不斷上升，給患者的家庭和社會帶來巨大的負擔。脊髓損傷包括不可逆性的由由創(chuàng)傷機制所決定的原發(fā)性損傷和可逆性的繼發(fā)性損傷。繼發(fā)性脊髓損傷在損傷的脊髓組織及周圍組織產(chǎn)生了一系列的病理反應，如出血、水腫、微循環(huán)障礙、局部組織氧自由基增多等改變，這些病理反應加重了脊髓組織的損傷，它所產(chǎn)生的損害遠遠超過原發(fā)性損傷。因此

2、早期應用針對脊髓繼發(fā)性損傷的有效藥物治療不可忽視。
　　 目前國內(nèi)外研究的治療藥物主要集中在以下幾類:皮質(zhì)激素、神經(jīng)營養(yǎng)因子(Neurotrophic factors，NTFS)、興奮性氨基酸(Excitatory Amino acid，EAA)受體拮抗劑、鈣通道拮抗劑(Calcium Channel Blockers)、抗氧化劑及自由基清除劑(Antioxidants and Free Radical Scavengers)、

3、前列腺素(Prostaglandin，PG)、阿片受體拈抗劑(Opioid Receptor Antagonists)、環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)抑制劑和特異性COX-2抑制劑等。目前臨床上公認的常用的有肯定療效的藥物是甲基強的松龍(MP)，在脊髓損傷后8小時內(nèi)應用超大劑量的甲基強的松龍可以減輕脊髓損傷后繼發(fā)性水腫，改善微循環(huán)，抑制脂質(zhì)過氧化反應，減少氧自由基的生成，減輕鈣離子內(nèi)流，維持神經(jīng)元的興奮性，促進神經(jīng)功能

4、的恢復，從而避免了脊髓組織的進一步損傷。但甲基強的松龍的治療時間僅限在傷后8小時以內(nèi)，如在脊髓損傷8小時以后應用，不僅效果欠佳，并且會出現(xiàn)并發(fā)癥。其他藥物大部分只針對脊髓損傷的某一環(huán)節(jié)有效，而脊髓損傷的繼發(fā)性損傷是多種機制共同作用的結果，所以治療效果有限。因此聯(lián)合不同作用機制的藥物治療脊髓損傷會成為今后的研究方向。
　　 近年來，隨著高通量藥物篩選技術的出現(xiàn)，為實現(xiàn)藥物篩選的微量、快速和大規(guī)模目標開辟了新的途徑，但其自身有一定的

5、局限性。如以往實驗室進行藥物篩選多采用多孔板進行，不僅在實驗過程中消耗的試劑量大，而且在實驗樣品的分配的過程中操作步驟十分的繁瑣，而微流控芯片技術的出現(xiàn)則有可能克服高通量藥物篩選的限制。微流控芯片技術是在微加工技術的基礎上形成的，它之所以可以成為組織工程研究及藥物篩選的新平臺是因為其具有分析過程所消耗的試劑量少、分析速度快，并且本身易于集成和高通量分析等許多優(yōu)點。
　　 他克莫司(Tacrolimus，F(xiàn)K506)是一種大環(huán)內(nèi)酯

6、類抗生素，具有極強的免疫抑制作用。新近研究表明，F(xiàn)K506具有保護大鼠脊髓損傷后的局部神經(jīng)組織，促進神經(jīng)再生，減少神經(jīng)細胞凋亡，促進脊髓功能恢復等作用。神經(jīng)生長因子(NGF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTFS)家族中的一員，廣泛分布于周圍組織、外周神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)。脊髓損傷后運動神經(jīng)元可誘導NGFR表達，將外源性NGF注射到脊髓損傷部位，使NGF與NGFR相結合，可以保護神經(jīng)元，促進軸突再生。研究證實FK506聯(lián)合NGF在促進損傷的周圍神經(jīng)

7、再生和營養(yǎng)神經(jīng)的功能方面具有協(xié)同作用，在脊髓損傷的治療中是否也具有相同的作用未見報道。
　　 本實驗將微流控芯片技術引入到促神經(jīng)再生研究領域，構建成以PC12細胞為效應細胞的促神經(jīng)再生藥物篩選體系，對FK506、NGF的促神經(jīng)再生作用進行探索，并將二者聯(lián)合應用治療大鼠急性脊髓損傷，探討二者在促進脊髓損傷后的功能恢復上是否具有協(xié)同作用。
　　 實驗一微流控芯片的設計、制作及芯片上PC12細胞的培養(yǎng)
　　 目的:構建

8、成集細胞培養(yǎng)、藥物干預及蛋白檢測為一體的微流控芯片檢測平臺。
　　 方法:以Jeon等提出的濃度梯度生成原理為基礎，設計出一種由濃度梯度生成器(Concentration Gradient Generator，CGG)和細胞培養(yǎng)單元組成，適用于細胞水平的促神經(jīng)再生藥物篩選的微流控芯片。微流控芯片的基本材料為聚二甲基硅氧烷(PDMS)和載玻片，SU-8負膠母板是利用光刻工藝制作而成。母板制成后將聚二甲基硅氧烷采用澆筑法制成含有微通

9、道的基片，并將基片等離子活化后封接到載玻片上，從而制成完整的微流控細胞培養(yǎng)芯片。在芯片上培養(yǎng)PC12細胞，觀察細胞生長、增殖情況。
　　 結果:構建成由上游的濃度梯度生成器(Concentration Gradient Generator，CGG)和下游的細胞培養(yǎng)單元組成的微流控芯片。實現(xiàn)了芯片上細胞培養(yǎng)。
　　 結論:在微流控芯片上可成功實現(xiàn)細胞培養(yǎng)，為進一步的藥物干預，及蛋白檢測提供可靠的檢測平臺。
　　 實

10、驗二運用微流控芯片探討FK506、NGF對PC12細胞軸突生長的影響
　　 目的:基于微流控芯片檢測平臺及PC12細胞，構建成促神經(jīng)生長藥物篩選體系，對FK506、NGF的促神經(jīng)再生作用進行探索，為二者聯(lián)合應用治療神經(jīng)損傷提供理論依據(jù)。
　　 方法:利用三個不同的微流控芯片上的濃度梯度生成器生成不同的FK506、NGF以及二者聯(lián)合的濃度梯度，作用于芯片上細胞培養(yǎng)單元中培養(yǎng)的PC12細胞48小時，采用免疫熒光細胞化學的方法

11、測定PC12細胞NF200表達情況以反映其軸突生長程度，以此篩選出FK506、NGF促進PC12細胞軸突生長的最佳藥物配伍濃度。為了驗證實驗結果的準確性及有效性，我們在相同實驗條件下采用多孔板法進行實驗加以驗證。
　　 結果:FK506在200nM的濃度下使PC12細胞NF200表達最強，NGF在50ng/mL的濃度下使PC12細胞NF200表達最強，F(xiàn)K506(114.29nM)與NGF(21.43ng/mL)的組合使PC12

12、細胞NF200表達最強，軸突產(chǎn)生最大的生長效應。與多孔板法進行比較顯示兩種結果無明顯差異(P＞0.05)。
　　 結論:聯(lián)合應用FK506、NGF在促進PC12細胞軸突生長中具有協(xié)同作用，F(xiàn)K506(114.29nM)與NGF(21.43ng/mL)的組合在PC12細胞軸突生長中具有最大促進作用。與傳統(tǒng)檢測平臺相比，微流控芯片具有分析過程中所消耗的試劑量少、分析速度快，并且本身易于集成和高通量分析等許多優(yōu)點。
　　 實驗

13、三聯(lián)合應用FK506、NGF治療大鼠脊髓損傷的實驗研究
　　 目的:觀察聯(lián)合應用FK506、NGF對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)再生及功能恢復的影響。
　　 方法:120只SD大鼠隨機分成損傷對照組、FK506治療組、NGF治療組、FK506聯(lián)合NGF治療組，假手術組。采用Allen's法制造大鼠急性脊髓損傷模型，于造模后30分鐘各治療組分別予FK506(0.3mg/kg)，NGF(40ug/kg)，F(xiàn)K506+NGF(0.3mg

14、/kg+40ug/kg)腹腔注射治療，以后每日一次，持續(xù)治療一周。大鼠脊髓損傷后的第3、7、14，21天采用HE染色觀察脊髓組織病理變化，采用免疫組織化學方法檢測NF200表達情況，采用RT-PCR方法檢測NF200mRNA表達情況，并且采用BBB評分觀察脊髓功能恢復情況。
　　 結果:傷后第7、14、21天，各治療組在BBB評分、NF200表達，NF200mRNA表達上均高于損傷對照組，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，其中聯(lián)合