我國間日瘧原蟲乙胺嘧啶抗性基因dhfr突變的分子流行病學(xué)研究.pdf

1、瘧原蟲抗藥性的產(chǎn)生和迅速擴(kuò)散使全球瘧疾防治面臨嚴(yán)重困難。特別是瘧原蟲已對多種抗瘧藥物產(chǎn)生抗藥性，致使全球瘧疾發(fā)病率和死亡率迅速回升，每年有3 至5億瘧疾病例和至少一百萬人因感染瘧疾死亡。應(yīng)對這一嚴(yán)峻形勢，除了采取研發(fā)疫苗及新型抗瘧藥等措施，還迫切需要建立不同地區(qū)瘧原蟲藥物抗性基因的突變及其流行規(guī)律、起源、分布、分子進(jìn)化和種群結(jié)構(gòu)等分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)庫，這對降低瘧原蟲抗性的影響以及制定相應(yīng)的防治策略均具有重要作用。研究表明，乙胺嘧啶抗性是由

2、瘧原蟲二氫葉酸還原酶基因的突變所致，且抗性程度與不同突變的單倍型相關(guān)。本研究采集我國不同地區(qū)間日瘧原蟲樣本，檢測間日瘧原蟲二氫葉酸還原酶(Pvdhfr)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)及單倍型，旨在分析我國乙胺嘧啶抗性蟲株的流行狀況及分布。通過檢測Pvdhfr基因側(cè)翼微衛(wèi)星多態(tài)性及間日瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白(PvCSP)的基因多態(tài)性，探討我國間日瘧原蟲乙胺嘧啶抗性基因Pvdhfr 突變的起源與傳播。間日瘧原蟲樣本采集自我國三個主要瘧疾流行區(qū)，即云

3、南省、海南省、及華中地區(qū)的安徽、河南、湖北省。云南樣本主要采集自怒江上下游流域，2005 至2009年采集全血/紙/片樣本共計277例；海南樣本主要采集自發(fā)病率較高的西部及南部山區(qū)，2003 至2007年采集濾紙/片樣本共計58例；華中樣本均采集于2007 至2008年，皖、豫、鄂三省的濾紙樣本數(shù)分別為252260和48例。我們選用QIAamp DNA Mini Kit 制備基因組DNA全血及濾紙血樣分別按照血液樣本及血斑樣本實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)

4、行處理。玻片樣本經(jīng)85℃預(yù)熱、溶解后，參照血斑樣本實(shí)驗(yàn)方案抽提基因組DNA為確保擴(kuò)增的靈敏度與特異性，我們設(shè)計了兩對特異性引物，采用巢式PCR 擴(kuò)增dhfr 片段全長。我們對三個地區(qū)共計556 份樣本進(jìn)行測序，共檢測到Pvdhfr基因在7個位點(diǎn)發(fā)生了非同義突變，導(dǎo)致第1357586199117和173 位氨基酸變異，其中以117N/T 突變頻率最高，占總樣本的69.6％；其它等位基因突變依次為58R57I/L61M和99S分別占總樣本的

5、39.2％、29.7％、28.2％和18.9％；173F和13L的突變頻率較低，占總樣本的1.1％和1.8；84例樣本未檢測出點(diǎn)突變，占總樣本的15.1％。另外，在Pvdhfr基因的串聯(lián)重復(fù)序列GGDN 島內(nèi)，169例樣本表現(xiàn)為第98 至103 位氨基酸缺失，6例樣本在第103 位氨基酸后表現(xiàn)為18 或36個堿基插入。三個地區(qū)Pvdhfr基因的SNP和單倍型差異明顯。云南地區(qū)間日瘧樣本的突變位點(diǎn)數(shù)目和單倍型種類最多。突變位點(diǎn)包括非同義突

6、變13L57I/L58R61M99S117N/T173F與同義突變15A38G69Y134V 單倍型共計18種，其中ILRMHTI和IIRMHTI兩種四重突變型流行最廣泛，分別占云南地區(qū)樣本數(shù)的35.7％和22.2％；其次為ILSMHTI等三重突變型，占11.7％；IFRTHNI等雙重突變型占10.9％；IFSTHNI等單重突變型占13.4％；野生型僅占云南地區(qū)樣本數(shù)的6.1％。52例樣本有GGDN 島內(nèi)第98 至103 位氨基酸的缺失

7、。所有海南地區(qū)間日瘧樣本皆檢測到第58R和117N位點(diǎn)突變，且只表現(xiàn)為一種單倍型IFRTHNI 串聯(lián)重復(fù)序列GGDN 島內(nèi)均無缺失或插入(indel)。華中地區(qū)間日瘧樣本檢測到99S和117N 位點(diǎn)突變，但第99 位點(diǎn)氨基酸突變與乙胺嘧啶抗性無關(guān)。單倍型種類包括野生型IFSTHSI單重突變型IFSTHNI和IFSTSSI雙重突變型IFSTSNI在華中地區(qū)樣本中，河南和安徽均以單重突變型IFSTHNI為主，分別占本省樣本數(shù)的48.1％和3

8、7.1％，而在湖北省樣本中野生型占大多數(shù)。另外，華中地區(qū)間日瘧樣本在串聯(lián)重復(fù)區(qū)表現(xiàn)出相對豐富的indel 安徽、河南、湖北的indel 比例分別為39.7％、41.9％和68.75％。此外，在分析我國Pvdhfr基因突變及單倍型的基礎(chǔ)上，結(jié)合葉酸代謝通路中另一關(guān)鍵靶酶——二氫蝶呤合成酶(Pvdhps)的點(diǎn)突變特征，我們進(jìn)行了Pvdhfr和dhps基因中各抗性相關(guān)突變位點(diǎn)的連鎖分析。除Pvdhfr基因58 位與117 位和Pvdhps基因

9、382 位與383 位及383 位與553 位有明顯連鎖外，5 號染色體Pvdhfr基因117 位與14 號染色體Pvdhps基因383 位間存在跨染色體的連鎖不平衡，這可能由乙胺嘧啶/磺胺多辛的選擇性壓力造成，兩位點(diǎn)在抗性種群中被固定為靜態(tài)的連鎖位點(diǎn)。為探討我國間日瘧原蟲Pvdhfr 突變的起源與分子流向，我們檢測了其側(cè)翼微衛(wèi)星多態(tài)性。微衛(wèi)星選擇的標(biāo)準(zhǔn)為：構(gòu)成重復(fù)元件的核苷酸數(shù)最少為2最多為5 重復(fù)次數(shù)最少為8 最大重復(fù)單位長度不超過

10、100bp 可選擇完全重復(fù)型、不完全重復(fù)型及復(fù)合型；微衛(wèi)星分布于抗性基因上下游相應(yīng)區(qū)域，位于非編碼區(qū)?；谝陨蠘?biāo)準(zhǔn)，我們選擇了位于dhfr上游93kb38kb2.6kb和下游4.9kb37kb94kb的六個微衛(wèi)星，分別命名為u93u38u2.6d4.9d37和d94從上述單倍型中選擇了4種，即IFSTH/SSI組、IFSTHNI組、IFRTHNI組和II/LRMHTI組，分別代表野生型蟲株和不同抗性程度（低、中、高）蟲株。根據(jù)樣本來源地

11、不同，再對IFSTHNI組、IFRTHNI組和II/LRMHTI組單倍型進(jìn)行華中地區(qū)、海南、云南三個地區(qū)的進(jìn)一步分型。每個微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計2 至3對引物，經(jīng)巢式或半巢式PCR 獲得特異性好的目的條帶。用QIAxcel 毛細(xì)管凝膠電泳儀檢測后，以軟件Bio Calculator 進(jìn)行數(shù)據(jù)采集與輸出。若在某位點(diǎn)出現(xiàn)兩個或兩個以上峰形，次/峰比值>1/3 且次峰相對峰面積大于30％，即認(rèn)為存在兩個峰值；如重復(fù)實(shí)驗(yàn)仍無改善，則判斷該樣本為多克隆感

12、染，從樣本分析數(shù)據(jù)中刪除。我們對上述微衛(wèi)星數(shù)據(jù)進(jìn)行以下分析：運(yùn)用GENALExMS tools 計算等位基因頻率、平均等位基因數(shù)目和期望雜合度；運(yùn)用Network構(gòu)建中央連接網(wǎng)絡(luò)圖，通過微衛(wèi)星多態(tài)性分析各進(jìn)化路徑的交叉關(guān)系，判斷多種不同的單倍型是獨(dú)立起源還是由同一起源經(jīng)突變累積進(jìn)化而成。六個微衛(wèi)星位點(diǎn)均顯示出多態(tài)性，共檢測到57個等位基因。不同抗性程度蟲株組在各微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因頻率、等位基因數(shù)目及期望雜合度均有差別。其中，野生型蟲株

13、組在各個位點(diǎn)始終保持高度的多態(tài)性，雜合度在0.70.8 之間；低度抗性IFSTHNI組在u2.6 位點(diǎn)雜合度值降至0.32 高度抗性II/LRMHTI組在d4.9 位點(diǎn)雜合度值降至0.29以各微衛(wèi)星位點(diǎn)距Pvdhfr基因的物理距離為橫坐標(biāo)，期望雜合度值為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖，可見各抗性組在毗鄰Pvdhfr 附近的微衛(wèi)星處雜合度降低，呈低谷趨勢，表明抗性在種群內(nèi)以選擇性掃蕩方式擴(kuò)散。此外，低度抗性IFSTHNI組、中度抗性IFRTHNI組、高

14、度抗性II/LRMHTI組在u2.6 位點(diǎn)的主要等位基因型分別為265260290/295在d4.9 位點(diǎn)的主要等位基因型分別為112/114122112顯示出不同的多態(tài)性特征。在與Pvdhfr 緊密毗鄰的微衛(wèi)星u2.6 位點(diǎn)，II/LRMHTI組雜合度未降低，這是由于等位基因型290和295的平均分布。由地理隔離帶或小區(qū)間瘧疾防治的差異引起四重突變株在省內(nèi)發(fā)生兩次不同起源的概率極小，更可能的原因是偏向性突變對總核苷酸數(shù)較大的微衛(wèi)星的限

15、制作用致使微衛(wèi)星不穩(wěn)定，故我們認(rèn)為云南省四重突變株在省內(nèi)是唯一、獨(dú)立起源。高度抗性組中兩例河南樣本HM3HM4在u2.6 位點(diǎn)的微衛(wèi)星長度與來自華中地區(qū)的IFSTHNI組數(shù)值相同，推測華中四重突變型仍為本地起源，而非云南省四重突變株輸入；根據(jù)中度抗性組與高度抗性組在u2.6 位點(diǎn)的等位基因頻率分布的差異和聯(lián)系，我們認(rèn)為海南云南的抗性蟲株是經(jīng)藥物壓力篩選各自獨(dú)立產(chǎn)生，但不排除兩地不同株系間的輸入及重組的可能。利用微衛(wèi)星數(shù)據(jù)構(gòu)建的中央連接網(wǎng)

16、絡(luò)圖顯示三種抗性單倍型各自聚集成簇、彼此遠(yuǎn)離，證實(shí)了三地抗性蟲株皆為獨(dú)立起源。我們還選取了IFSTHNI組、IFRTHNI組和II/LRMHTI組中90例樣本，進(jìn)行間日瘧環(huán)子孢子蛋白（PvCSP的巢式PCR 擴(kuò)增和測序；CSP蛋白是蚊體內(nèi)瘧原蟲對外界信號識別和轉(zhuǎn)導(dǎo)、運(yùn)動及免疫逃避的重要蛋白，其中央重復(fù)基序可反映媒介按蚊與瘧原蟲的相對適應(yīng)性。序列分析表明，華中樣本與云南海南樣本在中央?yún)^(qū)九肽重復(fù)單位的排列組成上差異明顯，這極可能與傳瘧媒介類

17、型有關(guān)。我們推測，即使由人員流動等因素造成抗性蟲株輸入，來自云南或海南的抗性蟲株也不能適應(yīng)華中本地的節(jié)肢動物宿主，無法促成新一輪抗性傳播。在識別為VK210型的云南和海南樣本中，九肽重復(fù)單位組成相似；而在為數(shù)相對少的、識別為VK247 型的云南和海南樣本中，九肽重復(fù)單位組成雖相似，但中央重復(fù)基序后的插入?yún)^(qū)則顯示出序列差異。如前所述，不排除云南海南兩地不同株系之間的入侵及重組的可能，但兩地間日瘧樣本在Pvdhfr單倍型和微衛(wèi)星多態(tài)性上的差

18、異表明，本地起源的抗性蟲株仍在當(dāng)?shù)乇３纸^對優(yōu)勢。小結(jié)：我國間日瘧原蟲在乙胺嘧啶抗性基因Pvdhfr上有廣泛的點(diǎn)突變特征。但云南、海南、及華中三地間日瘧樣本的Pvdhfr基因的SNP和單倍型差異明顯。云南地區(qū)樣本的突變位點(diǎn)數(shù)目多、突變頻率高、單倍型種類多，提示整體抗性程度較高；海南地區(qū)全部樣本都含有與抗性密切相關(guān)的突變位點(diǎn)，但單倍型固定；華中地區(qū)僅發(fā)現(xiàn)與抗性相關(guān)的單重突變，且所占比例相對較低；以上分子特征與各地乙胺嘧啶用藥史和瘧疾流行特征

19、吻合。同時，我們識別了三個乙胺嘧啶抗性蟲株的起源地—云南、海南和華中地區(qū)，抗性在種群內(nèi)均以選擇性掃蕩方式傳播。海南與云南的抗性蟲株經(jīng)由藥物壓力篩選、各自獨(dú)立產(chǎn)生；華中地區(qū)出現(xiàn)的四重突變型仍為本地起源，是在單重突變株的基礎(chǔ)上積累進(jìn)化形成。本研究樣本的來源地包括南部瘧疾高傳播區(qū)及中部疫情不穩(wěn)定區(qū)，能真實(shí)反映我國間日瘧原蟲乙胺嘧啶抗性流行程度及抗性產(chǎn)生傳播狀況，為建立我國瘧原蟲抗藥性蟲株分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)庫提供資料；同時證實(shí)了微衛(wèi)星檢測和分析技