貝氏柯克斯體抗原誘導(dǎo)人樹突狀細(xì)胞活化的研究.pdf

1、貝氏柯克斯體（Coxiella burnetii）為Q熱(Qfever)病原體，專性胞內(nèi)寄生的革蘭陰性嗜酸菌。該菌的高致病性和對(duì)環(huán)境、理化因素的強(qiáng)抵抗力使其成為重要的生物戰(zhàn)劑/生物恐怖劑。疫苗接種為預(yù)防貝氏柯克斯體感染的有效手段。雖然滅活貝氏柯克斯體全菌Q熱疫苗具有良好的免疫保護(hù)效果，但是較強(qiáng)的副作用限制了它的推廣應(yīng)用。為研發(fā)安全有效的分子Q熱疫苗，有必要研究貝氏柯克斯體主要抗原引發(fā)的機(jī)體免疫應(yīng)答機(jī)制。
　　 樹突狀細(xì)胞(den

2、dritic cells，DCs)作為吞噬細(xì)胞的一種，是體內(nèi)專職的抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cells，APCs)，在啟動(dòng)和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。DCs分化成熟過程中具有未成熟(immature dendritic cells，iDCs)與成熟(mature dendritic cells，reDes)兩個(gè)階段，iDCs負(fù)責(zé)攝取加工處理抗原，當(dāng)受到抗原刺激時(shí)，iDCs迅速分化為mDCs，mDCs呈遞攝取

3、的抗原給T細(xì)胞，刺激T細(xì)胞活化，因而DCs是一種理想的生物免疫佐劑和抗原載體。
　　 本研究建立了從人外周血分離單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化成DCs的培養(yǎng)體系，直接從濃縮白細(xì)胞中分離出單核細(xì)胞，加入IL-4與GM-CSF誘導(dǎo)后使其分化為人源DCs。以CD83表達(dá)量作為衡量DCs成熟度的指標(biāo)，分析體外誘導(dǎo)培養(yǎng)DCs表面T細(xì)胞共刺激分子CD86、CDS0、CD40、CD54、CD58、HLA-DR(MHCⅡ)、HLA-ABC(MHCⅠ)的表達(dá)。

4、
　　 用滅活貝氏柯克斯體Ⅰ相強(qiáng)毒新橋株和Ⅱ相弱毒Grita株分別刺激DCs，發(fā)現(xiàn)它們誘導(dǎo)人源DCs活化水平差異明顯。Ⅱ相弱毒株刺激DCs各表面分子的表達(dá)量是Ⅰ相強(qiáng)毒株刺激的1-2倍；貝氏柯克斯體強(qiáng)、弱毒株的差別主要是LPS的不同，Ⅰ相強(qiáng)毒株LPS刺激DCs表面分子表達(dá)水平與Ⅰ相強(qiáng)毒株相似，而去LPS強(qiáng)毒株刺激DCs表面分子表達(dá)水平與弱毒株相似，表明貝氏柯克斯體強(qiáng)毒株LPS不能有效激活人源DCs，無法使DCs由未成熟狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橥?/p>

5、全成熟狀態(tài)；提示貝氏柯克斯體強(qiáng)毒株的LPS掩蓋了菌體外膜蛋白，致使DCs表面受體無法與貝氏柯克斯體表面蛋白相互識(shí)別，產(chǎn)生激活信號(hào)。
　　 貝氏柯克斯體coml、icmO，enhA、secB、lolA、hspB基因分別編碼外膜蛋白Coml、Ⅳ分泌系統(tǒng)蛋白IcmO、增強(qiáng)入侵蛋白EnhA、蛋白輸出蛋白SecB、外膜脂質(zhì)載體蛋白LolA以及熱休克蛋白HspB，其中Coml蛋白與HspB蛋白在免疫印跡中與貝氏柯克斯體感染血清反應(yīng)強(qiáng)。6種重

6、組蛋白對(duì)人源DCs的激活能力有強(qiáng)有弱：Coml激活DCs能力最強(qiáng)，它所激活DCs的表面分子表達(dá)水平最高，甚至強(qiáng)于大腸桿菌LPS, SecB激活DCs能力僅次于Coml，其刺激作用與大腸桿菌LPS不相上下；而HspB激活DCs的能力最弱，除個(gè)別表面分子的表達(dá)量在其刺激下稍有增加外，大部分表面分子尤其是成熟標(biāo)志分子CD83的表達(dá)量僅為基礎(chǔ)表達(dá)水平。Coml、SecB、HspB刺激人源DCs的表達(dá)的細(xì)胞因子也大不相同。Coml激活DCs和Se

7、cB激活DCs均表達(dá)相對(duì)高水平的細(xì)胞因子IL-12，而HspB刺激誘導(dǎo)出的不成熟DCs表達(dá)相對(duì)較高水平細(xì)胞因子IL-10。表型成熟度與表達(dá)細(xì)胞因子的不同表明Coml、SecB、HspB刺激的DCs處于不同活化狀態(tài)，提示貝氏柯克斯體不同蛋白抗原刺激的DCs可以表現(xiàn)不同的免疫調(diào)節(jié)能力。
　　 為觀察處于不同活化狀態(tài)的DCs對(duì)T細(xì)胞免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，將Coml、SecB、HspB刺激DCs及其培養(yǎng)上清分別刺激同種同體T細(xì)胞。與DCs分子

8、表型相應(yīng)，HspB刺激DCs和培養(yǎng)上清對(duì)T細(xì)胞的活化也顯示出明顯惰性，T細(xì)胞表面早期活化標(biāo)志物CD69的表達(dá)僅有限上調(diào)，對(duì)T細(xì)胞的增殖毫無作用，表明HxpB不具有啟動(dòng)機(jī)體細(xì)胞免疫的功能。Coml激活DCs和SecB激活DCs及培養(yǎng)上清均顯著提高T細(xì)胞表面CD69表達(dá)，尤其Coml激活DCs培養(yǎng)上清誘導(dǎo)T細(xì)胞CD69表達(dá)量達(dá)80％以上；CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞CD69的高表達(dá)，證明兩種T細(xì)胞處于活化狀態(tài)。Coml激活DCs和SecB