貝氏柯克斯體質(zhì)粒生物學(xué)作用與功能研究.pdf

1、貝氏柯克斯體（Coxiella burnetii，簡稱Cb）是一種革蘭氏陰性、專性胞內(nèi)寄生菌，是引起人類Q熱的病原體[1-3]。Cb主要通過氣溶膠[4]、蜱蟲叮咬等途徑，在人與動物之間進行傳播，是已知的感染性最強的病原體之一，也是一種潛在的生物戰(zhàn)劑[5]和生物恐怖劑[6]。
　　研究發(fā)現(xiàn)：已知的Cb分離株中均含有一種質(zhì)粒（QpH1[7]、QpRS[8]、QpDG[9]、QpDV[10,11]）或者整合到Cb基因組的質(zhì)粒同源序列（I

2、PS[8,12]）；Cb質(zhì)粒編碼多個IV型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白[13,14]，這些蛋白分泌到宿主細胞質(zhì)后，參與調(diào)控細胞功能[15]。長期以來，Cb質(zhì)粒（包括IPS）被認為可能是菌體生長或胞內(nèi)寄生所需的關(guān)鍵因子，又或者可能跟Cb的環(huán)境耐受和所引起的疾病種類（急性Q熱或慢性Q熱）相關(guān)。由于培養(yǎng)困難及缺少Cb質(zhì)粒的遺傳操作方法，Cb質(zhì)粒及其編碼基因的生物學(xué)功能和致病機制均缺乏研究。近年來，無生命培養(yǎng)基ACCM[16,17]培養(yǎng)Cb方法的建立，推動

3、了Cb的遺傳學(xué)研究進展，為研究Cb基因的功能創(chuàng)造了機遇。
　　本論文參考國外已有的Cb遺傳操作方法[18,19]，通過基因工程技術(shù)構(gòu)建Cb穿梭載體，建立了Cb的遺傳轉(zhuǎn)化方法；利用質(zhì)粒相似不兼容機制[20-22]，成功構(gòu)建了Cb內(nèi)源質(zhì)粒QpH1缺失突變體，并在體內(nèi)、外對Cb質(zhì)粒缺失突變體的表型和毒力變化等進行了初步的探討；利用基因敲除和定點突變等技術(shù)，對Cb內(nèi)源質(zhì)粒QpH1的復(fù)制與分裂調(diào)控區(qū)進行了深入的探討。
　　第一章，基于

4、E.coli質(zhì)粒pMMB207[23]，構(gòu)建含RSF1010 ori的貝氏柯克斯體自主穿梭載體，建立貝氏柯克斯體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。首先，利用PCR技術(shù)分別擴增綠色熒光蛋白基因（eGFP）、卡那霉素抗性基因（KanR）、Cb組成型表達基因啟動子P311和P1169四段序列，以及含RSF1010 ori的載體骨架p207；然后，用融合PCR技術(shù)將四段序列融合為“P311-eGFP-P1169-KanR”串聯(lián)序列；最后，用限制性核酸內(nèi)切酶Kpn I和

5、Xho I酶切“P311-eGFP-P1169-KanR”串聯(lián)序列，連接至同樣雙酶切的載體骨架p207上，構(gòu)建穿梭載體p207GK。將穿梭載體 p207GK電轉(zhuǎn)化至Cb Grita II相株，用無生命培養(yǎng)基ACCM-2進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，利用倒置熒光顯微鏡觀察eGFP基因的表達，傳代至eGFP基因高表達時，用單層半固體“ACCM-2/Kan/瓊脂”平板克隆分純Cb轉(zhuǎn)化株；結(jié)果成功構(gòu)建了自主的Cb穿梭載體，獲得了穩(wěn)定表達eGFP的Cb轉(zhuǎn)化株

6、，并完成了克隆分純。表明我們成功建立了Cb遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，為后續(xù)用遺傳學(xué)方法研究Cb奠定了基礎(chǔ)。
　　第二章，生物信息學(xué)分析本室Cb Grita II相株質(zhì)粒全長序列，確定該質(zhì)粒為QpH1（GeneBank Accession No.AE016829），BLAST比對分析發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒的CBUA0036～CBUA0039a序列片段在IPS中缺失，但在4種質(zhì)粒（QpH1，QpRS，QpDG，QpDV）中存在且高度保守，推測該段序列可能是調(diào)

7、控Cb質(zhì)粒復(fù)制與分裂的功能區(qū)，包含復(fù)制起始位點序列和相關(guān)質(zhì)粒分裂調(diào)控蛋白基因。利用PCR擴增技術(shù)，從質(zhì)粒QpH1上擴增獲得包含CBUA0036～CBUA0039a序列的片段，作為同源型質(zhì)粒的骨架（命名為pQ）；同時利用融合PCR擴增技術(shù)，使 eGFP基因、KanR基因、P311和P1169啟動子，以及pUC ori序列融合，形成“P311-eGFP-P1169-KanR-pUC ori”串聯(lián)序列；把串聯(lián)序列亞克隆至載體骨架pQ上，構(gòu)建新

8、型穿梭載體pQGK。將新型穿梭載體pQGK電轉(zhuǎn)化至Cb Grita II相菌中，用含Kan的無生命培養(yǎng)基ACCM-2進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，通過熒光顯微鏡進行觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)新型穿梭載體pQGK能在Cb中穩(wěn)定地傳代，熒光激發(fā)下使Cb轉(zhuǎn)化菌呈現(xiàn)綠色熒光，這說明新型穿梭載體pQGK上的CBUA0036～CBUA0039a序列片段含有pQGK質(zhì)粒的復(fù)制起始位點序列（ori）。對轉(zhuǎn)化菌克隆分純后，用QpH1質(zhì)粒特異性引物對Cb克隆株進行PCR鑒定，未能

9、檢測到QpH1質(zhì)粒，說明Cb克隆株中的QpH1質(zhì)粒已經(jīng)丟失，獲得了Cb內(nèi)源質(zhì)粒QpH1缺失突變株CbGrita II/pQGK；利用SYBR Green絕對定量Q-PCR技術(shù)分別測定Cb野生株中QpH1質(zhì)粒和突變株Cb Grita II/pQGK中pQGK質(zhì)粒的相對拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)QpH1與pQGK質(zhì)粒都只有單拷貝；以上數(shù)據(jù)說明QpH1與pQGK質(zhì)粒具有相同的復(fù)制與分裂調(diào)控機制，兩者在Cb中不能共存，表明CBUA0036～CBUA0039a

10、這段序列能嚴(yán)格地調(diào)控質(zhì)粒QpH1的復(fù)制、分裂及相似不兼容。用Q-PCR技術(shù)測定突變株Cb Grita II/pQGK在細胞外（ACCM-2）和細胞內(nèi)（BGM）的增殖能力，發(fā)現(xiàn)突變株和野生株無論是在囊泡形成與生長，還是在Cb菌體增殖方面，均無明顯無差別，這結(jié)果提示Cb質(zhì)粒QpH1的大部分序列（CBUA0001～CBUA0034a，＞85％）與Cb在胞內(nèi)和胞外的正常生長無關(guān)。通過體內(nèi)（SCID小鼠）和體外（THP-1細胞）實驗發(fā)現(xiàn)突變株的毒

11、力下降，提示QpH1質(zhì)粒是Cb的一個毒力因子。
　　第三章，以穿梭載體pQGK為基礎(chǔ)，深入探索CBUA0036～CBUA0039a這段序列調(diào)控QpH1質(zhì)粒復(fù)制和分裂的機制。通過基因敲除或序列刪除的方法，對穿梭質(zhì)粒pQGK上的CBUA0036～CBUA0039a這段序列進行不同程度地刪減，構(gòu)建一系列穿梭載體pQGK的突變體，命名為pQGK-D1～pQGK-D17。將這些穿梭載體分別電轉(zhuǎn)化至Cb Grita II，用含Kan的ACCM

12、-2培養(yǎng)基進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，通過熒光顯微鏡進行觀察，當(dāng)eGFP基因高表達時，對Cb轉(zhuǎn)化菌進行克隆分純；之后對Cb克隆株進行PCR鑒定分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有14個穿梭載體（pQGK-D1～pQGK-D14）能成功轉(zhuǎn)化Cb并穩(wěn)定傳代；序列比較分析顯示，只需含最短為600 bp的序列（介于CBUA0036和CBUA0037之間）即可使穿梭載體pQGK-D14在Cb內(nèi)穩(wěn)定地傳代，而含更短序列片段的穿梭載體（pQGK-D15～pQGK-D17）無法獲

13、得Cb轉(zhuǎn)化菌，說明這段600 bp的序列包含Cb質(zhì)粒QpH1的復(fù)制起始位點序列（ori）。隨后對已經(jīng)克隆分純的Cb克隆菌進行PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)穿梭載體pQGK-D1和pQGK-D5均能敲除Cb Grita II內(nèi)源質(zhì)粒QpH1；穿梭載體pQGK-D7～-D8、pQGK-D11～-D14與QpH1質(zhì)粒共存，到目前為止，以上結(jié)果表明QpH1質(zhì)粒的復(fù)制、分裂和相似不兼容，除了復(fù)制起始位點（ori）外，還受到其它未知因子的調(diào)控（實驗進行中，詳細結(jié)

14、果待補充）。
　　第四章，在前期研究的基礎(chǔ)上，利用基因克隆技術(shù)，把穿梭載體pQGK上的KanR基因替換成RifR基因，構(gòu)建新型穿梭載體pQGR，并電轉(zhuǎn)化Cb Grita II及克隆分純。在ACCM-2培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)在相同時間內(nèi)，pQGR轉(zhuǎn)化株Cb Grita II/pQGR的增殖能力比pQGK轉(zhuǎn)化株Cb Grita II/pQGK要明顯下降；感染BGM后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在胞內(nèi)只能形成細小的空泡，未能進一步發(fā)展成經(jīng)典的大空泡，且Cb

15、菌體增殖能力明顯下降；感染THP-1細胞后，無空泡形成，亦未能檢測到Cb菌體在細胞內(nèi)增殖。上述結(jié)果說明，RifR基因的表達產(chǎn)物ADP-核糖基化酶在Cb內(nèi)可能具有核糖基化作用，影響Cb正常的生物合成，使Cb減毒，對Cb感染細胞后空泡的發(fā)展和菌體增殖具有顯著的抑制作用，表明RifR基因不適合作為Cb遺傳轉(zhuǎn)化研究中的藥物篩選標(biāo)記。
　　綜上所述，本研究成功構(gòu)建了基于RSF1010 ori的自主穿梭載體p207GK，并利用該穿梭載體建立了

16、Cb的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；隨后，成功構(gòu)建了與Cb質(zhì)粒QpH1具有同源序列（CBUA0036～CBUA0039a）的新型穿梭質(zhì)粒pQGK，并利用該穿梭載體成功敲除Cb內(nèi)源質(zhì)粒QpH1，獲得QpH1質(zhì)粒缺失突變體；對CBUA0036～CBUA0039a這段序列進行深入的研究后，發(fā)現(xiàn)QpH1質(zhì)粒的復(fù)制起始位點序列區(qū)；此外，實驗過程中還發(fā)現(xiàn)RifR基因編碼產(chǎn)物ADP-核糖基化酶對Cb的生物合成具有顯著的影響，不適合用來作為Cb遺傳轉(zhuǎn)化的藥物篩選標(biāo)記。