氯仿-甲醇提取貝氏柯克斯體殘存組分Q熱疫苗的研制及其免疫保護(hù)性和安全性初步評(píng)價(jià).pdf

1、貝氏柯克斯體(Coxiella burnetii，又稱Q熱立克次體)為Q熱病原體。該病原體為專性細(xì)胞內(nèi)寄生菌，可通過氣溶膠傳播，對(duì)人和動(dòng)物的感染性極強(qiáng)，是一種重要的生物戰(zhàn)劑/生物恐怖劑。人、畜對(duì)貝氏柯克斯體普遍易感，畜牧相關(guān)從業(yè)人員是高危人群。不管是預(yù)防貝氏柯克斯體自然感染還是防生物武器/生物恐怖均需要有效的Q熱疫苗對(duì)易感人群進(jìn)行免疫接種。 本研究將國(guó)內(nèi)分離的貝氏柯克斯體新橋株在雞胚大量繁殖，然后從感染雞胚中分離、純化貝氏柯克斯

2、體，用甲醛滅活純化貝氏柯克斯體，制備全細(xì)胞疫苗(WCV)，同時(shí)采用氯仿-甲醇提取WCV，制備氯仿-甲醇提取殘存組分疫苗(CMR)。采用高壓氣相色譜測(cè)定了兩種疫苗的脂肪酸，發(fā)現(xiàn)CMR較WCV減少了11種脂肪酸，其中4種為不飽和脂肪酸，4種為支鏈脂肪酸，70％為C原子數(shù)≥18的較長(zhǎng)鏈的脂肪酸。另外，兩種疫苗的支鏈脂肪酸與直鏈脂肪酸、不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比值也明顯不同。通過蛋白單相及雙向電泳分析兩種疫苗蛋白，它們的蛋白電泳圖譜和主要高豐

3、度蛋白點(diǎn)的蛋白豐度均無明顯差異。 采用CMR和WCV免疫BALB/c小鼠，間接免疫熒光法分析免疫小鼠血清特異性抗體水平，結(jié)果顯示CMR與WCV一樣均能誘導(dǎo)高水平特異性抗體產(chǎn)生。CMR加Al(OH)3佐劑免疫小鼠，該免疫小鼠特異性抗體水平顯著高于CMR單獨(dú)免疫。用MTT法體外分析免疫小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示CMR誘導(dǎo)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖水平顯著高于WCV，而WCV對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖有一定程度的抑制。免疫小鼠體內(nèi)、外細(xì)胞因子的

4、測(cè)定結(jié)果顯示，CMR疫苗能誘導(dǎo)TNF-α、IFN-γ及IL-10等多種細(xì)胞因子的分泌。 用貝氏柯克斯體Ⅰ相強(qiáng)毒株(包括疫苗制備株和美國(guó)分離Nine Mile株和歐洲分離的Henzerling)攻擊免疫小鼠，用熒光定量PCR分析小鼠脾臟貝氏柯克斯體的量。結(jié)果顯示CMR與WCV一樣能有效保護(hù)小鼠抵抗貝氏柯克斯體的攻擊。CMR加Al(OH)3佐劑免疫小鼠的脾臟貝氏柯克斯體的量顯著少于CMR單獨(dú)免疫。 用大劑量WCV免疫小鼠，在

5、接種部位出現(xiàn)皮下結(jié)節(jié)，小鼠的脾臟明顯腫大，組織病理學(xué)檢查脾臟有不同程度的網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞增生。檢查免疫小鼠肝臟功能指標(biāo)，ALT和AST均明顯升高。而相同大劑量CMR免疫小鼠則無上述病理學(xué)變化和肝功能損傷。 WCV疫苗是目前唯一得到美國(guó)FDA批準(zhǔn)應(yīng)用的Q熱疫苗，雖然其具有良好的免疫保護(hù)效果，但其明顯的副作用使得其應(yīng)用受到嚴(yán)格限制。本研究證明采用國(guó)內(nèi)分離株制備的CMR疫苗與WCV疫苗的免疫保護(hù)效果相當(dāng)，但是CMR疫苗的副作用明顯小于W