隱孢子蟲棒狀體cgd8-2530蛋白sushi片段亞單位疫苗和核酸疫苗的制備及其免疫保護(hù)性研究.pdf

1、頂復(fù)門原蟲是一類專性的細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，包括剛地弓形蟲、隱孢子蟲、瘧原蟲、巴貝斯蟲和球蟲等，是人和動(dòng)物的重要病原。這類原蟲具有相似的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)并能分泌與入侵相關(guān)的保守蛋白，尤其是在入侵宿主細(xì)胞階段分泌的棒狀體蛋白(rhoptryproteins，ROPs)被認(rèn)為是協(xié)助寄生蟲入侵和繁殖的關(guān)鍵分子。
　　微小隱孢子蟲（Cryptosporidium parvum）屬專性腸道寄生性原蟲，在免疫功能正常的宿主通常是自限性的。但免疫缺陷的宿主

2、感染后，如艾滋病患者等則可能危及生命。目前，尚未見報(bào)道有效治療隱孢子蟲感染的藥物，因此，疫苗是未來防控本病的重要策略之一。
　　本研究根據(jù)Cryptodb數(shù)據(jù)庫(http://cryptodb.org/cryptodb/)中登錄的微小隱孢子蟲棒狀體蛋白cgd8_2530編碼基因中的sushi結(jié)構(gòu)域基因片段序列（共708bp）設(shè)計(jì)引物，利用PCR技術(shù)將該基因片段從微小隱孢子蟲基因組DNA中擴(kuò)增出來，然后連接到原核表達(dá)載體pET28a

3、(+)上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-sushi并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果顯示，sushi結(jié)構(gòu)域基因在大腸桿菌中高效表達(dá)。將純化的重組蛋白免疫新西蘭白兔制備多克隆抗體，Western blot分析顯示重組蛋白能被微小隱孢子蟲sushi結(jié)構(gòu)域基因重組表達(dá)蛋白免疫兔血清識(shí)別，表明表達(dá)的重組蛋白具有較好的反應(yīng)原性和免疫原性。
　　將sushi基因片段連接到pVAX1質(zhì)粒，成功構(gòu)建了真核重組表達(dá)質(zhì)粒pVAX-sus

4、hi，與sushi亞單位疫苗共同免疫ICR小鼠，并設(shè)置健康組、空白組、TE組、pVAX1質(zhì)粒組、佐劑組，對(duì)各組誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)比較;，觀察ICR小鼠感染泰澤隱孢子蟲(C.tyzzeri)后的免疫保護(hù)效果。結(jié)果顯示，sushi亞單位疫苗組ICR小鼠血清中特異性IgG抗體、脾臟CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量、淋巴細(xì)胞增殖及各細(xì)胞因子IFN-γ、TNF、IL-4、IL-5、IL-12p70等免疫水平均顯著增高，表明亞單位疫苗能誘

5、導(dǎo)小鼠產(chǎn)生Th1/Th2混合型免疫反應(yīng)。減卵實(shí)驗(yàn)顯示，亞單位疫苗免疫組無排卵高峰;排卵量明顯減少，減卵率可達(dá)89％，表明制備的sushi亞單位疫苗能明顯地誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，對(duì)隱孢子蟲感染具有良好的免疫保護(hù)作用。而pVAX-sushi試驗(yàn)組CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量、淋巴細(xì)胞增殖及各細(xì)胞因子指標(biāo)也呈現(xiàn)顯著升高的趨勢(shì)，可以產(chǎn)生Th1/Th2混合型細(xì)胞免疫反應(yīng)，但明顯低于亞單位疫苗組;血清中特異性IgG抗體水平與其他對(duì)照組比