Caveolae-Gαq相互作用在機(jī)械刺激誘導(dǎo)心肌肥大反應(yīng)中的作用.pdf

1、高血壓，血容量增加，局部心肌缺血損傷或先天性心肌疾病等均可導(dǎo)致局部或整體的心肌細(xì)胞負(fù)荷增加，心肌細(xì)胞受過度牽拉作用導(dǎo)致的機(jī)械刺激可發(fā)生適應(yīng)性的代償反應(yīng)一心肌肥厚。心肌肥厚即是心律失常和猝死的危險(xiǎn)因素，也可導(dǎo)致隨后發(fā)生的心肌缺血和心衰反應(yīng)。目前，對(duì)于機(jī)械刺激誘導(dǎo)的心肌肥厚反應(yīng)并沒有明確有效的治療方法，且其發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚。目前有觀點(diǎn)認(rèn)為，機(jī)械刺激可促進(jìn)心肌細(xì)胞，心肌成纖維細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞等分泌一系列促進(jìn)細(xì)胞增生和肥大反應(yīng)的生物活性物

2、質(zhì)，如血管緊張素II，內(nèi)皮素，緩激肽等。這些生物活性物質(zhì)中有很大一部分為G aq受體的激動(dòng)劑，可以通過激活細(xì)胞內(nèi)G aq受體信號(hào)通路進(jìn)而影響細(xì)胞基因的表達(dá)和蛋白的合成。這種自分泌/旁分泌的作用被認(rèn)為是機(jī)械刺激誘導(dǎo)心肌肥大反應(yīng)過程中的一個(gè)重要機(jī)制。有證據(jù)表明，Caveolae可感受細(xì)胞外的機(jī)械刺激并在心肌肥大的發(fā)生發(fā)展過程中起了重要的作用。我們的前期研究結(jié)果表示Gaq蛋白及其偶聯(lián)的受體可能位于Caveolae結(jié)構(gòu)中，且Caveolae可影

3、響G aq受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性。
　　因此，本研究擬探討機(jī)械刺激對(duì)Caveolae及Gaq信號(hào)通路的直接作用，觀察機(jī)械刺激除通過自分泌/旁分泌機(jī)制間接作用于細(xì)胞內(nèi)的G aq信號(hào)通路外，可否通過Caveolae直接影響細(xì)胞內(nèi)的G aq信號(hào)通路，介導(dǎo)下游基因的表達(dá)和蛋白的合成。
　　實(shí)驗(yàn)一機(jī)械刺激對(duì)Caveolae結(jié)構(gòu)和G蛋白與Caveolin蛋白共定位的影響
　　目的：觀察機(jī)械刺激對(duì)細(xì)胞膜表面Caveola

4、e結(jié)構(gòu)和G蛋白與Caveolin蛋白共定位的影響。
　　方法：使用不同滲透壓的Hank’s平衡鹽溶液（Hank’s Balanced Salt Solution，HBSS)分別處理正常的A10細(xì)胞，Caveolin-1基因敲除的A10細(xì)胞和Caveolae結(jié)構(gòu)被甲基-P-環(huán)糊精（Methyl-P-Cyclodextrin，mpCD)破壞的A10細(xì)胞，觀察機(jī)械刺激對(duì)細(xì)胞直徑的影響。使用焚光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（Fluorescence

5、Resonamce Energy Transfbr，F(xiàn)RET)和光漂白后焚光恢復(fù)技術(shù)（Fluorescence Recovery after Photobleaching，F(xiàn)RAP)觀察機(jī)械刺激（150m0sm低滲刺激）對(duì)Caveolae結(jié)構(gòu)的影響。隨后米用FRET技術(shù)，焚光壽命成像技術(shù)（Fluorescence Lifbtim e Imaging Microscopy，F(xiàn)LIM)和免疫熒光（Immunofluorescence，IF)

6、染色技術(shù)觀察機(jī)械刺激對(duì)細(xì)胞膜表面蛋白G a q蛋白和恥腎上腺素受體（P2-adrenergic receptor，P2-AR)與Caveolin蛋白間共定位的影響。
　　結(jié)果：正常A10細(xì)胞在90 mOsm時(shí)出現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)意義的細(xì)胞直徑的變化， Caveolin-1基因敲除的A10細(xì)胞和Caveolae結(jié)構(gòu)被mpCD破壞的A10細(xì)胞分別在135 mOsm和120m0sm出現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)意義的細(xì)胞直徑的變化，說明A10細(xì)胞在Caveola

7、e結(jié)構(gòu)消失后對(duì)機(jī)械刺激的作用更加敏感。機(jī)械刺激可減少A10細(xì)胞膜表面GFP-Caveolin-1蛋白與 mCherry-Caveolin-1蛋白間的FRET值，使 Caveolae結(jié)構(gòu)內(nèi)C aveolin-1蛋白間的距離增加。機(jī)械刺激不影響A10細(xì)胞膜表面轉(zhuǎn)染的GFP-Caveolin-1蛋白的FRAP結(jié)果，但可使Alexa Fluor-488標(biāo)記的A10細(xì)胞膜表面內(nèi)源性Caveolin-1蛋白的FRAP速率增加，時(shí)間變短。說明機(jī)械刺激

8、可增加細(xì)胞膜表面Caveolae的直徑，并改變其主要結(jié)構(gòu)蛋白Caveolin-1的構(gòu)象。Gaq蛋白與Caveolin蛋白間存在共定位現(xiàn)象，且機(jī)械刺激可使A10細(xì)胞和狗原代心室肌細(xì)胞膜表面Caveolin-1/3蛋白與Gctq蛋白間的距離增加，共定位減少，F(xiàn)RET值降低。但A10細(xì)胞膜表面[32-AR受體與Caveolin-1蛋白間不存在FRET現(xiàn)象，且不受機(jī)械刺激的影響。這說明機(jī)械刺激可特異性影響細(xì)胞膜表面部分G蛋白與Caveolin蛋

9、白的共定位。結(jié)論：Caveolae可緩沖機(jī)械刺激對(duì)細(xì)胞形態(tài)和體積的影響；機(jī)械刺激可破壞細(xì)胞膜表面Caveolae的正常結(jié)構(gòu)，改變Caveolin-1蛋白的構(gòu)象，增加Caveolae的直徑;進(jìn)而影響細(xì)胞膜表面Gaq蛋白與Caveolin蛋白間的距離。
　　實(shí)驗(yàn)二機(jī)械刺激對(duì)細(xì)胞膜表面Caveolae結(jié)構(gòu)及其相關(guān)蛋白共定位的超清晰顯微成像研究
　　目的：觀察緩激肽受體B2受體（Bradykinin Receptor B2，B2R)

10、，Gaq和G a i蛋白在Caveolae結(jié)構(gòu)內(nèi)的定位以及機(jī)械刺激對(duì)其的影響。
　　方法:采用隨機(jī)光學(xué)重建顯微技術(shù)（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy， STORM)觀察A IO細(xì)胞膜表面Caveolae的結(jié)構(gòu)以及機(jī)械刺激對(duì)其結(jié)構(gòu)的影響，使用Image J軟件分析所得到的圖像，比較機(jī)械刺激對(duì)A10細(xì)胞膜表面Caveolae直徑和形態(tài)的影響。采用超清晰顯微成像技術(shù)STORM觀察A

11、10細(xì)胞膜表面B2R，Gaq和Gai蛋白與Caveolin-1蛋白的共定位關(guān)系以及機(jī)械刺激對(duì)其的影響。使用Anaconda軟件分析所得到的圖像，比較機(jī)械刺激對(duì)A10細(xì)胞膜表面Caveolin-1蛋白與B2R，Gaq和Gai蛋白間的距離分布直方圖，以及機(jī)械刺激對(duì)其的影響，隨后將所得到的圖像使用Im ageJ軟件進(jìn)行最近鄰點(diǎn)距離（NeajestNeighborDistance，NND)分析，比較A10細(xì)胞膜表面Caveolin-1，B2R，

12、Gaq和G ai蛋白的分布及機(jī)械刺激對(duì)其的影響。
　　結(jié)果：Caveolae為細(xì)胞膜表面50?100 n m大小的凹陷結(jié)構(gòu)，機(jī)械刺激可增加Caveolae的直徑，改變Caveolae的形態(tài)，但不釋放Caveolin-1蛋白。機(jī)械刺激可增加B2R受體和G aq蛋白與Caveolin-1蛋白分子間的距離，使B2R受體和G aq蛋白與Caveolin-1蛋白間距離分布直方圖的峰值右移，但不影響G a i蛋白與Caveolin-1蛋白間的

13、距離。Caveolin-1蛋白在細(xì)胞膜表面的分布集中在40nm左右的范圍內(nèi)，機(jī)械刺激可使Caveolin-1蛋白的分布曲線右移。而B2R受體，Gaq蛋白和G a i蛋白在細(xì)胞膜表面的分布集中在80 n m左右的范圍內(nèi)，且機(jī)械刺激對(duì)其分布影響不明顯。
　　結(jié)論：B2R，Gaq和Gai三種蛋白均可位于Caveolae結(jié)構(gòu)中，機(jī)械刺激使B2R受體和G a q蛋白與Caveolin-1蛋白間的距離增加，但不影響Gai蛋白與Caveolin

14、-1蛋白間的距離。
　　實(shí)驗(yàn)三機(jī)械刺激對(duì)細(xì)胞膜表面受體的運(yùn)動(dòng)和寡聚化狀態(tài)的影響
　　目的：觀察機(jī)械刺激對(duì)細(xì)胞膜表面Caveolin-1蛋白，B2R和恥-AR受體分布，運(yùn)動(dòng)以及寡聚化狀態(tài)的影響。
　　方法:采用Z-stack掃描技術(shù)，觀察A10細(xì)胞膜表面Caveolin-1蛋白，B2R和p2-AR受體的分布以及機(jī)械刺激對(duì)其的影響。使用焚光相關(guān)光譜技術(shù)（Fluorescence CorrelationSpectroscop

15、y，F(xiàn)CS)，觀察A10細(xì)胞膜表面B2R受體和P2-AR受體的運(yùn)動(dòng)情況以及機(jī)械刺激對(duì)其的影響。將所得到的FCS數(shù)據(jù)進(jìn)行光子計(jì)數(shù)直方圖（Photon CountHistogram，PCH)分析，觀察A10細(xì)胞膜表面B^R受體和p2-AR受體的寡聚化狀態(tài)以及機(jī)械刺激對(duì)其的影響。
　　結(jié)果：Caveolin-1蛋白，B2R受體和R-AR受體均集中于A10細(xì)胞的基底細(xì)胞膜，在頂端細(xì)胞膜的分布較少，機(jī)械刺激可促進(jìn)Caveolin-1蛋白和[

16、32-A R受體向頂端細(xì)胞膜移動(dòng)，但不影響B(tài)2R受體在細(xì)胞膜表面的分布。B2R受體和p2-A R受體在A10細(xì)胞膜表面的運(yùn)動(dòng)均可分為兩組，一組受體在細(xì)胞膜表面的運(yùn)動(dòng)較快，另一組受體在細(xì)胞膜表面的運(yùn)動(dòng)較慢，在A10細(xì)胞的頂端細(xì)胞膜和底端細(xì)胞膜均可觀察到這種現(xiàn)象，且機(jī)械刺激不影響A10細(xì)胞膜表面B2R受體和[32-AR受體的運(yùn)動(dòng)能力。此外，B2R受體和h-AR受體在A10細(xì)胞膜表面均可以單聚體和寡聚體兩種形式存在，在A10細(xì)胞的頂端細(xì)胞膜和

17、底端細(xì)胞膜均可觀察到這種現(xiàn)象，且機(jī)械刺激不影響A10細(xì)胞基底細(xì)胞膜和頂端細(xì)胞膜B2R受體和恥-AR受體的寡聚化狀態(tài)。
　　結(jié)論：機(jī)械刺激促進(jìn)Caveolin-1蛋白和恥-AR受體向頂端細(xì)胞膜移動(dòng)，但不影響B(tài)2R在細(xì)胞膜表面的分布；機(jī)械刺激不影響B(tài)2R受體和恥-AR受體在A10細(xì)胞膜表面的運(yùn)動(dòng)和寡聚化狀態(tài)。
　　實(shí)驗(yàn)四機(jī)械刺激對(duì)G蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的影響
　　目的：觀察機(jī)械刺激對(duì)G蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的影響

18、r>　　方法：采用媽離子特異性焚光標(biāo)記物Fura-2和Calcium Green記錄A10細(xì)胞內(nèi)Gaq-PLCp_Ca2+信號(hào)通路對(duì) M型膽堿能受體（Muscajinic Acetylcholine Receptors， mAchRs)激動(dòng)劑Carbachol的反應(yīng)，以及機(jī)械刺激對(duì)其的影響。同時(shí)觀察Carbachol對(duì)Caveolim-1基因敲除的A10細(xì)胞和Caveolae結(jié)構(gòu)被mpCD破壞的A10細(xì)胞內(nèi)Gaq-PLCP-Ca2+信號(hào)

19、通路的影響。采用鈣離子熒光標(biāo)記物Fum-2記錄A10細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度對(duì)細(xì)胞外生長(zhǎng)因子刺激的反應(yīng)，以及機(jī)械刺激對(duì)其的影響。采用cA M P探針I(yè)CUE3，觀察[3腎上腺素受體激動(dòng)劑Isoprenaline對(duì)細(xì)胞內(nèi)Gas/God-AC-cAMP信號(hào)通路的影響，以及機(jī)械刺激對(duì)其的影響。
　　結(jié)果：機(jī)械刺激可減弱Carbachol誘導(dǎo)的A10細(xì)胞內(nèi)Gaq-PLCp_Ca2+信號(hào)通路的激活，Caveolin-1基因敲除或Caveolae結(jié)

20、構(gòu)破壞具有同樣的作用，也可減弱Carbachol誘導(dǎo)的A10細(xì)胞內(nèi)Gaq-PLCP-Ca2+信號(hào)通路的激活，且Caveolin-1基因敲除后，機(jī)械刺激對(duì)Carbachol誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Gaq-PLC]3-Ca2+信號(hào)通路無(wú)影響。與 Carbachol誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+反應(yīng)相比，生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+反應(yīng)速度較慢，幅度較小，且對(duì)機(jī)械刺激無(wú)影響。與Carbachol誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+反應(yīng)相比，Isoprenaline誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)cA

21、MP反應(yīng)速度較慢，持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，且不受機(jī)械刺激的影響。
　　結(jié)論:機(jī)械刺激可減弱Carbachol誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Gaq-PLC)3-Ca2+信號(hào)通路的激活，但不影響生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+反應(yīng)和Isoprenaline誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Gas/Gai-AC-cAMP信號(hào)通路的變化。
　　小結(jié):
　　通過以上四部分實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)機(jī)械刺激可改變細(xì)胞膜表面Caveolae的結(jié)構(gòu)，增加Caveolae的直徑，減少Caveolin蛋