Nanos1基因在日本血吸蟲生殖器官中的功能研究.pdf

1、目的：Nanos基因編碼一種含鋅指結(jié)構(gòu)的RNA結(jié)合蛋白，可以與其起協(xié)同作用的Pumilio蛋白結(jié)合，在原始生殖細(xì)胞生存相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起到重要作用。Nanos蛋白在時(shí)間、空間上對基因轉(zhuǎn)錄翻譯和mRNA定位的調(diào)控，是啟動果蠅胚胎后極化發(fā)育過程的關(guān)鍵機(jī)制。Nanos基因在原始生殖細(xì)胞的遷移和分化過程中發(fā)揮重要的功能，并且在秀麗隱桿線蟲、斑馬魚、家蠶、非洲蟾蜍和小鼠等測試動物的生長發(fā)育方面也起到必不可少的作用。由于Nanos基因與大多數(shù)物

2、種生殖器官的發(fā)育密切相關(guān)，因此我們推測日本血吸蟲Nanos基因編碼的蛋白在其生殖器官的發(fā)育中也起一定的作用。
　　方法：首先，使用DNAMAN軟件和NCBI中BLAST，進(jìn)行Nanos蛋白的同源性分析，來確定日本血吸蟲Nanos的分型；然后再通過原位雜交的方法，探究Nanos基因在日本血吸蟲的定位情況；隨后，用針對Nanos基因的siRNA轉(zhuǎn)染感染后28天合抱的日本血吸蟲，體外培養(yǎng)10天，期間每隔3天轉(zhuǎn)染一次siRNA，共轉(zhuǎn)染三次

3、；使用TRIzol方法提取蟲體總RNA和總蛋白，通過熒光定量PCR以及Western blot方法分析其在mRNA和蛋白水平的消減情況；Nanos基因干擾后，使用鹽酸胭脂紅染色蟲體的方法，通過激光共聚焦掃描顯微鏡觀察日本血吸蟲生殖器官的形態(tài)改變；我們還使用普通光學(xué)顯微鏡觀察Nanos基因的干擾對日本血吸蟲蟲卵數(shù)量的影響；最后，在Nanos基因消減后，通過熒光定量PCR方法檢測可能與Nanos基因相互作用以及蟲卵形成相關(guān)基因表達(dá)水平的變化

4、。
　　結(jié)果：Nanos蛋白同源性分析結(jié)果顯示，日本血吸蟲Nanos1（SjNanos1）蛋白與曼氏血吸蟲Nanos2蛋白同源性為43%，與曼氏血吸蟲Nanos1蛋白同源性為25%。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，曼氏血吸蟲Nanos2主要表達(dá)在卵黃腺中，可能與生殖系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)，故將SjNanos1基因作為本課題的研究對象；原位雜交的結(jié)果顯示，SjNanos1基因主要表達(dá)在合抱后日本血吸蟲雌蟲和雄蟲生殖器官中，而合抱前的日本血吸蟲并未發(fā)現(xiàn)SjNan

5、os1基因的表達(dá)；SjNanos1基因的siRNA干擾后，與空白組相比，SjNanos1的表達(dá)在mRNA和蛋白質(zhì)水平均顯著降低；激光共聚焦掃描顯微鏡的觀察結(jié)果顯示，SjNanos1基因消減后，在日本血吸蟲雄蟲中，睪丸輕微收縮，并且在睪丸的腹側(cè)部分幾乎沒有觀察到成熟的細(xì)長的精子；同時(shí)，在每個(gè)睪丸中都發(fā)現(xiàn)有明顯的裂隙。對于血吸蟲雌蟲，其卵巢中成熟卵母細(xì)胞減少，不成熟卵母細(xì)胞增多，卵黃腺中成熟的卵黃細(xì)胞也明顯減少并且卵黃細(xì)胞也明顯萎縮；在Sj

6、Nanos1基因消減后，通過普通光學(xué)顯微鏡進(jìn)行蟲卵計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)雌蟲的產(chǎn)卵數(shù)量在第4、第7天和第10天時(shí)分別下降了大約41％、56％和71％，并且雌蟲子宮中蟲卵的數(shù)量也明顯減少，培養(yǎng)10天下降了50%左右；此外，SjNanos1基因沉默也影響了與SjNanos1基因相互作用的以及蟲卵形成相關(guān)基因的變化，如Pumilio，CNOT6L和Fs800基因。在SjNanos1基因干擾后第10天，Pumilio基因的表達(dá)量增加了3倍左右，CNOT6L