重組CTLA4-Ig融合蛋白的糖基化修飾分析及其對(duì)穩(wěn)定性和功能影響的研究.pdf

1、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是最常見(jiàn)的免疫系統(tǒng)紊亂性疾病之一，常常引起關(guān)節(jié)疼痛、腫脹以及全身性慢性疾病，全球大約有2千萬(wàn)患者。T細(xì)胞在這一過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用，抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)通過(guò)主要組織相容性復(fù)合體(major histo-compatibility complex，MHC)和免疫共刺激分子雙信號(hào)激活T細(xì)胞，通過(guò)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)多種細(xì)胞因子，如

2、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）和干擾素(interferon，IFN)等的釋放，從而導(dǎo)致骨骼、關(guān)節(jié)等組織的損傷。常用藥物為Adalimumab(ADA)，Etanercept(ETN)，Infliximab(IFX)，Rituximab(RTX)，Tocilizumab(TOC)以及Abatacept(ABT)。它們的作用機(jī)理主要分為兩類(lèi):其一，

3、針對(duì)級(jí)聯(lián)反應(yīng)終末期的細(xì)胞因子，阻斷其發(fā)揮生物學(xué)功能，從而減少骨骼、關(guān)節(jié)等組織的損傷，如ADA、ETN、IFX等;其二，針對(duì)反應(yīng)的啟動(dòng)階段，阻止T細(xì)胞的激活，從而在源頭阻斷免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，其典型代表為ABT。ABT在2005年被FDA批準(zhǔn)用于治療頑固性RA，已經(jīng)過(guò)十余年的臨床應(yīng)用，安全性和有效性獲得確認(rèn)。
　　本文的研究對(duì)象，ABT是一個(gè)融合蛋白，又叫CTLA4-Ig，由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T-ly

4、mphocyte-associated antigen4，CTLA4)的胞外段和修飾的IgG1抗體Fc（鉸鏈區(qū)、恒定區(qū)2和恒定區(qū)3）組成。其通過(guò)CTLA4與APC上的白細(xì)胞分化抗原80（cluster of differentiation80，CD80，B7-1）或者白細(xì)胞分化抗原86(cluster ofdifferentiation86，CD86，B7-2)結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)T細(xì)胞上的CD28，從而阻斷T細(xì)胞的活化，進(jìn)而抑制免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致

5、IL和TNFα等細(xì)胞因子釋放減少，這些細(xì)胞因子在RA的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了非常重要的作用。因而，ABT在RA的治療中獲得了良好的效果。
　　相比小分子化學(xué)藥物，蛋白類(lèi)藥物具有明顯的自身優(yōu)勢(shì)，比如特異性好，副作用低，體內(nèi)靶向分布，并且能夠通過(guò)多種途徑發(fā)揮治療作用。但是，由于蛋白類(lèi)藥物都是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)、分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、含大量的翻后修飾，以及生產(chǎn)工藝復(fù)雜等特點(diǎn)，使得制藥公司在對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量研究及產(chǎn)品放行的難度加大。大量的研究發(fā)

6、現(xiàn)翻譯后修飾對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能具有重要的影響，例如抗體類(lèi)藥物Fc上的N糖，除了對(duì)抗體的抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)和補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用(complement-dependent cytotoxicity, CDC)具有重要的影響外，還對(duì)抗體的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性及酶的敏感性方面也具有重要影響。而CTLA4-Ig作為融合蛋白既有可結(jié)晶片

7、段（crystallizable fragment，F(xiàn)c）部分，也有CTLA-4胞外段，這兩部分都存在復(fù)雜的糖基化修飾。雖然FDA在2005年就已批準(zhǔn)用于臨床，但是對(duì)其糖基化修飾研究報(bào)道很少，并且其還存在復(fù)雜的O-糖基化修飾;再者糖基化修飾對(duì)其結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和功能影響的研究未見(jiàn)報(bào)道。本課題詳細(xì)表征CTLA4-Ig融合蛋白的糖基化修飾，進(jìn)而明確這些糖基化修飾與其穩(wěn)定性和功能間的關(guān)系，為CTLA4-Ig融合蛋白的質(zhì)量控制提供參考，同時(shí)為CTL

8、A4-Ig生物類(lèi)似藥研究打下基礎(chǔ)。
　　本課題采用超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(ultra performance liquidchromatography-electrospray ionization-quadrupole-time of flight, UPLC-ESI-Q-ToF)、差示掃描量熱（differential scanning calorimetry, DSC）、分子排阻色譜(size exclusio

9、n chromatography，SEC)、差示掃描熒光(differential scanning fluoroscopy，DSF)、ForteBio結(jié)合活性，以及細(xì)胞生物學(xué)活性等技術(shù)，從糖基化修飾水平對(duì)CTLA4-Ig融合蛋白進(jìn)行了全面的表征分析;并通過(guò)應(yīng)用多種酶對(duì)CTLA4-Ig融合蛋白進(jìn)行處理，在此基礎(chǔ)之上，應(yīng)用多種檢測(cè)手段對(duì)CTLA4-Ig融合蛋白的穩(wěn)定性和功能進(jìn)行了研究。具體研究路線如下:
　　糖基化修飾表征分析部分:

10、在完整蛋白水平，因CTLA4-Ig融合蛋白含有多個(gè)N-糖基化和O-糖基化修飾，質(zhì)譜無(wú)法獲得有效信息;在亞單位水平，為了降低蛋白的復(fù)雜性以獲得更加詳盡的信息，我們應(yīng)用了多種酶（PNGase F、EndoF2、Neuraminidase和O-Glycosidase）對(duì)樣品進(jìn)行處理，然后應(yīng)用質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè);在質(zhì)量肽圖譜水平，通過(guò)胰酶對(duì)樣品進(jìn)行處理后，應(yīng)用質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè);在游離N-寡糖水平，首先應(yīng)用PNGase F酶切獲得游離N-寡糖，標(biāo)記2AB，

11、應(yīng)用熒光和質(zhì)譜對(duì)N-糖譜分別進(jìn)行定量和定性分析;其次應(yīng)用Ides酶將蛋白分為兩部分，應(yīng)用游離N-寡糖相同的檢測(cè)手段，對(duì)兩部分的N-寡糖水平分別進(jìn)行表征;在O-糖修飾水平，應(yīng)用糖苷酶(PNGase F)、唾液酸酶(Neuraminidase)和胰酶(Trypsin)處理樣品，獲得保留O-糖核心糖單元修飾的肽段，應(yīng)用LC-MS/MS對(duì)O-糖基化進(jìn)行定位研究。
　　糖基化與穩(wěn)定性和功能關(guān)系部分:我們應(yīng)用了多種糖苷酶(PNGase F、E

12、ndoF2、Neuraminidase和O-Glycosidase)對(duì)樣品進(jìn)行處理，并從酶切系統(tǒng)中分離純化出了處理后的CTLA4-Ig融合蛋白，以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。在穩(wěn)定性方面:第一，通過(guò)SEC測(cè)定不同酶切時(shí)間處理前后樣品純度的變化;第二，應(yīng)用0.22um的濾膜除菌后，進(jìn)行45℃下的加速實(shí)驗(yàn)，在0、1、3、5、7、9、11和12周取樣，通過(guò)SEC測(cè)定樣品純度的變化;第三，應(yīng)用DSF測(cè)定不同時(shí)間酶切處理后，樣品整體熱力學(xué)參數(shù)的變化;第四，

13、應(yīng)用DSC測(cè)定不同時(shí)間酶切處理，樣品各結(jié)構(gòu)域熱力學(xué)參數(shù)變化。在功能方面:對(duì)于Fc段結(jié)合活性，我們選擇報(bào)告基因法測(cè)定了酶切樣品與Fc受體的結(jié)合活性變化，也間接體現(xiàn)了CTLA4-Ig蛋白的ADCC活性變化;對(duì)于CTLA4段結(jié)合活性，我們應(yīng)用ForteBio技術(shù)，分別測(cè)定酶切前后樣品與B7-1和B7-2的親和力;對(duì)于細(xì)胞生物學(xué)活性，我們選擇報(bào)告基因法測(cè)定酶切樣品，阻斷Duadi細(xì)胞結(jié)合并激活Jurkat細(xì)胞的能力，以評(píng)估其生物學(xué)活性。

14、　　本研究證明，通過(guò)CHO表達(dá)系統(tǒng)培養(yǎng)獲得的CTLA4-Ig蛋白，含有非常復(fù)雜的糖基化修飾:其中6個(gè)N糖基化修飾，位于CTLA4段的4個(gè)N糖基化修飾相對(duì)比較復(fù)雜，含有大量的末端唾液酸修飾，而位于Fc段的兩個(gè)N糖基化修飾相對(duì)比較簡(jiǎn)單，與經(jīng)典的單克隆抗體的糖基化修飾相似;研究結(jié)果明確了O糖基化修飾的個(gè)數(shù)和位置，分別為鉸鏈區(qū)肽段上的第2、8、11和20位的絲氨酸，存在O糖基化修飾;并通過(guò)質(zhì)譜強(qiáng)度，初步確定了含不同O糖基化修飾個(gè)數(shù)的比例。通過(guò)不