血清與關(guān)節(jié)滑膜組織中Nesfatin-1變化在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度中的作用及臨床意義.pdf

1、骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種嚴(yán)重的關(guān)節(jié)疾病，關(guān)節(jié)軟骨破壞，使關(guān)節(jié)間隙變窄。在嚴(yán)重的情況下，當(dāng)關(guān)節(jié)完全失去軟骨，關(guān)節(jié)周圍的骨和軟組織結(jié)構(gòu)將開始發(fā)生變化，這可能導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、致殘。在美國，60歲或以上的成年人有癥狀的骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生率大約10％。根據(jù)最近的統(tǒng)計(jì)，在美國有930萬的成年人患有膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎。全球OA總?cè)藬?shù)高達(dá)4.0億以上。在亞洲平均每8個(gè)人中就有1人患本病。我國歲老齡化的來臨，OA患者逐年增多，

2、估計(jì)達(dá)2億左右。男女患病比例為1∶2。隨著老齡化社會(huì)的到來，人的膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的人數(shù)預(yù)計(jì)在未來幾十年里將增加，在2020年，骨性關(guān)節(jié)炎將被認(rèn)為是第四大傷殘?jiān)?。治療骨性關(guān)節(jié)炎的目的是緩解疼痛和腫脹，改善關(guān)節(jié)的活動(dòng)性。目前的治療方案，在幾個(gè)循證臨床指南推薦包括減肥、運(yùn)動(dòng)、口服藥物治療、局部治療、腔內(nèi)注射治療、非藥物治療和手術(shù)治療。這些不同的干預(yù)中，非甾體類抗炎藥和關(guān)節(jié)內(nèi)注射透明質(zhì)酸或糖皮質(zhì)激素在臨床的應(yīng)用更加普遍。然而，這樣在某些情況下

3、，治療可能無效或?qū)е聡?yán)重不良事件，在這種情況下，我們的研究為骨性關(guān)節(jié)炎的治療提供了新的方向。
　　OA發(fā)病的中心環(huán)節(jié)是關(guān)節(jié)軟骨的退變，而原因則是力學(xué)和生物學(xué)因素共同導(dǎo)致軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)及軟骨下骨的降解與合成失衡。適當(dāng)運(yùn)動(dòng)的力學(xué)刺激會(huì)限制軟骨退變，而創(chuàng)傷及過度負(fù)荷會(huì)導(dǎo)致軟骨破壞，發(fā)生OA。研究證明:力學(xué)刺激的種類、頻率、持續(xù)的時(shí)間及強(qiáng)度對(duì)軟骨細(xì)胞均有影響。超生理限度的異常應(yīng)力作用于軟骨時(shí)，使膠原纖維網(wǎng)架松弛，超微結(jié)構(gòu)破壞，膠原纖

4、維斷裂而發(fā)生軟骨退變?；菏腔りP(guān)節(jié)內(nèi)的一種清晰的具有高粘性的液體，為關(guān)節(jié)提供了液態(tài)環(huán)境。它在滑膜內(nèi)由滑膜襯里細(xì)胞分泌到關(guān)節(jié)腔內(nèi)。它具有潤(rùn)滑軟骨面的作用，對(duì)維持其低摩擦特性至關(guān)重要。它作為一種必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸載體把養(yǎng)料運(yùn)送到軟骨細(xì)胞。透明質(zhì)酸和潤(rùn)滑素等物質(zhì)是滑膜液的主要成份，這2種物質(zhì)是決定滑膜液粘度的主要因素。透明質(zhì)酸是唯一的非硫酸化糖胺聚糖，關(guān)節(jié)液中存在的量約3.4mg/dl-3.6mg/dl。透明質(zhì)酸是由氨基葡聚糖和葡萄糖酸組

5、成的，它是由透明質(zhì)酸合成酶的作用下而形成的，它是關(guān)節(jié)液和軟骨基質(zhì)的主要成分。通常在骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)中會(huì)出現(xiàn)非糜爛性滑膜炎。研究發(fā)現(xiàn)，直接和受損的關(guān)節(jié)軟骨相鄰的滑膜發(fā)生滑膜炎癥狀更嚴(yán)重。同時(shí)，骨關(guān)節(jié)炎的磨損顆粒和其他物質(zhì)的降解產(chǎn)物，可刺激滑膜細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子，從而增強(qiáng)外周滑膜組織的炎癥，促進(jìn)滑膜纖維化，導(dǎo)致滑膜透明質(zhì)酸的分解和缺乏或喪失，從而降低其濃度。
　　軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一的細(xì)胞，負(fù)責(zé)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和再生，保持基質(zhì)的完

6、整性。細(xì)胞凋亡是一種正常的生理過程，它是一種由基因控制的程序性細(xì)胞死亡過程，而不需要采取主動(dòng)去清除非細(xì)胞過程。正常人關(guān)節(jié)軟骨也會(huì)發(fā)生細(xì)胞凋亡，但檢出率非常之低，骨性關(guān)節(jié)炎患者細(xì)胞凋亡較正常關(guān)節(jié)組織有明顯的升高。研究人員進(jìn)行了測(cè)定正常人員和OA患者關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率分別為2-5％與18-21％，也有研究顯示是6.7％和28.7％，但始終表明大量出現(xiàn)病理性細(xì)胞凋亡普遍存在于骨關(guān)節(jié)炎患者。造成這種細(xì)胞凋亡現(xiàn)象主要分布在軟骨淺層和軟骨中間層，這

7、是一氧化氮合酶(iNOS)和NO表達(dá)最高的部位，也是蛋白多糖丟失最多的區(qū)域。
　　關(guān)節(jié)軟骨是一種非血管組織，具有與免疫系統(tǒng)相隔絕，沒有神經(jīng)和淋巴管的特點(diǎn)。免疫細(xì)胞通常不接觸軟骨細(xì)胞和基質(zhì)，實(shí)際上處在免疫隔離形態(tài)存在。在侵蝕性骨關(guān)節(jié)炎的滑膜的病理學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞和滑膜組織中淋巴細(xì)胞聚集，主要為CD3+T細(xì)胞。CD4+T和CD8+T細(xì)胞大多存在滑膜襯里層。在骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞在軟骨多糖和膠原纖維上有一個(gè)T細(xì)胞反應(yīng)

8、。一旦軟骨細(xì)胞受到機(jī)械應(yīng)力或炎癥因子的侵襲，軟骨細(xì)胞和基質(zhì)暴露于免疫系統(tǒng)，并可釋出“自身抗原”，受到免疫細(xì)胞所識(shí)別，引起自身免疫反應(yīng)。在侵蝕性骨關(guān)節(jié)炎的患者中，已發(fā)現(xiàn)自身抗體對(duì)軟骨細(xì)胞成分進(jìn)行攻擊。
　　Nesfatin-1是一個(gè)82個(gè)氨基酸的多肽，是在2006由日本學(xué)者oh-i及其同事首先描述，在大鼠與小鼠給藥能誘導(dǎo)焦慮，產(chǎn)生恐懼反應(yīng)，并降低食欲。此外，Bonnet等人在法國的研究發(fā)現(xiàn)Nesfatin-1與外周炎癥信號(hào)有密切關(guān)系

9、。Nesfatin能夠水解成三個(gè)片段，分別為Nesfatin-1、Nesfatin-2和Nesfatin-3。但只有Nesfatin-1具有抑制食欲作用，降低外周炎癥信號(hào)的作用。最初研究發(fā)現(xiàn)Nesfatin-1只存在于下丘腦的神經(jīng)元當(dāng)中，然而隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)其還存在于腦干及外周組織。近年的研究發(fā)現(xiàn)，Nesfatin-1能夠抗炎及抑制細(xì)胞凋亡，然而Nesfatin-1在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎中的作用仍未有報(bào)道。
　　目的：
　　本

10、研究擬從動(dòng)物模型角度，探討膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠血清及滑膜細(xì)胞Nesfatin-1水平變化，研究其與滑膜細(xì)胞凋亡的關(guān)系及通過何種途徑進(jìn)行調(diào)控，以為骨性關(guān)節(jié)炎的病因?qū)W研究提供科學(xué)依據(jù)，為骨性關(guān)節(jié)炎的治療提供新方向。
　　方法：
　　通過關(guān)節(jié)腔注射尿激酶建立膝關(guān)節(jié)炎大鼠模型，給予Nesfatin-1干預(yù)后，使用免疫組化、流式細(xì)胞術(shù)和western blot檢測(cè)病理變化、炎癥因子及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　

11、1.大鼠足跖部出現(xiàn)腫脹，關(guān)節(jié)明顯紅腫增粗，活動(dòng)受限。軟骨病理切片鏡下顯示對(duì)照組細(xì)胞排列整齊，染色均勻;OA組細(xì)胞排列紊亂、軟骨有潰瘍形成，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。進(jìn)行關(guān)節(jié)炎評(píng)分OA組符合關(guān)節(jié)炎的改變。對(duì)大鼠膝蓋直徑進(jìn)行測(cè)量，OA組有顯著的增大。
　　2.與Control組比較，OA組的IL-1β、TNF-α血清濃度有著明顯的升高，HA血清濃度明顯降低。
　　3.與Control組比較，OA組的無論是血清學(xué)濃度還是蛋白的表達(dá)，Nesf

12、atin-1的水平與對(duì)照組比較均有顯著的下降。
　　4.Nesfatin-1干預(yù)治療后，細(xì)胞凋亡情況明顯降低，并隨濃度增高而降低，高濃度組細(xì)胞凋亡率降低最明顯。
　　5.對(duì)caspase-3、caspase-7與caspase-9進(jìn)行檢測(cè)，可以獲得，經(jīng)過干預(yù)后其蛋白表達(dá)均有顯著的下降，有呈濃度依賴性，隨Nesfatin-1濃度增加而降低，以高濃度組蛋白表達(dá)下降最為顯著。
　　6.分別對(duì)IL-1β、TNF-α進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)

13、過干預(yù)后其血清濃度均有顯著的下降，有這濃度依賴性，隨Nesfatin-1濃度增加而降低，以高濃度組蛋白表達(dá)下降最為顯著。對(duì)HA進(jìn)行檢測(cè)，其血清濃度隨Nesfatin-1濃度增加而增高，其中高濃度組蛋白表達(dá)增高最為顯著。
　　7.經(jīng)過干預(yù)后，大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度在低濃度組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，隨著濃度增加，關(guān)節(jié)腫脹程度顯著下降，其中以高濃度組最為明顯。
　　8.在關(guān)節(jié)炎組CHOP與GRP78兩個(gè)蛋白強(qiáng)表達(dá)，隨著Nesfatin-1干預(yù)后兩

14、種蛋白表達(dá)量明顯降低，兩者呈現(xiàn)并有濃度依賴性，在高濃度組降低最為顯著。
　　9.在檢測(cè)CHOP與GRP78蛋白表達(dá)中，OA組的兩個(gè)蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，兩者比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　10.TG刺激后，凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、caspase-7及caspase-9的表達(dá)與對(duì)照組比較均有明顯的上調(diào)，而當(dāng)加入了Nesfatin-1后，這三組蛋白表達(dá)顯著降低。
　　結(jié)論：
　　1.對(duì)大鼠關(guān)節(jié)腔注射尿激酶