GGCX在原發(fā)性膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中的表達(dá)及其意義.pdf

1、研究目的:探討GGCX在原發(fā)性膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中的表達(dá)及其對正常軟骨細(xì)胞的生物學(xué)作用，從而為探討其在骨性關(guān)節(jié)炎中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　研究方法:收集20例原發(fā)性膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎和20例正常膝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)軟骨及關(guān)節(jié)液，對軟骨進(jìn)行固綠-番紅O染色后進(jìn)行組織學(xué)觀察，并根據(jù)改良的Mankin評分標(biāo)準(zhǔn)對骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行分組。應(yīng)用免疫組化的方法檢測GGCX在各組軟骨組織中的表達(dá)，使用RT-PCR方法檢測各組軟骨組織中GGCXmRN

2、A的表達(dá)，通過westernblot檢測各組軟骨組織中GGCX蛋白的表達(dá)，應(yīng)用磁分離化學(xué)發(fā)光免疫檢測法對關(guān)節(jié)液中GGCX的含量進(jìn)行檢測，所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　取正常膝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行軟骨細(xì)胞的分離及培養(yǎng)，并應(yīng)用甲苯胺藍(lán)染色和Ⅱ型膠原纖維染色對軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定。根據(jù)人GGCXmRNA序列，在線設(shè)計(jì)了三段siRNA序列，并在體外轉(zhuǎn)錄合成，利用LipofectamineTM2000將其轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的軟骨

3、細(xì)胞，應(yīng)用熒光鏡檢測轉(zhuǎn)染效率，并使用RT-PCR方法分別檢測三段siRNA轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞中GGCX mRNA的表達(dá)，通過western blot方法分別檢測三段siRNA轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞中GGCX蛋白的表達(dá)，比較三段siRNA對軟骨細(xì)胞中GGCX的干擾效率，選擇干擾效率最高的siRNA片段進(jìn)行干擾試驗(yàn)。
　　應(yīng)用干擾效率最高的siRNA片段對正常軟骨細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，研究干擾正常軟骨細(xì)胞中GGCX表達(dá)對軟骨細(xì)胞生物學(xué)的影響。使用MTT法

4、檢測轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞的的增殖率，通過Annexin V-FITC& PI法檢測軟骨細(xì)胞的凋亡率，應(yīng)用RT-PCR方法檢測軟骨細(xì)胞中MMP13、X型膠原、堿性磷酸酶mRNA的表達(dá)，western blot檢測軟骨細(xì)胞中MMP13、X型膠原、堿性磷酸酶的蛋白表達(dá)，所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　研究結(jié)果:GGCX在正常膝關(guān)節(jié)和原發(fā)性膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)軟骨中均有表達(dá)，其主要位于軟骨細(xì)胞的胞漿中，免疫組化的結(jié)果顯示G

5、GCX的表達(dá)在骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中明顯低于正常膝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)軟骨(P＜0.05)，RT-PCR及western blot的結(jié)果同樣提示原發(fā)性骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中GGCX mRNA表達(dá)及蛋白含量均顯著低于正常膝關(guān)節(jié)軟骨(P＜0.05)，而且隨著骨性關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度的提高，GGCX的表達(dá)、蛋白含量及mRNA均逐步降低，在輕度、中度、重度骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中這些差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。原發(fā)性膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎組關(guān)節(jié)液中GGCX的含量明顯低于正常組

6、(P＜0.05)。
　　為了進(jìn)一步探討GGCX對正常軟骨細(xì)胞生物學(xué)的影響，我們成功設(shè)計(jì)、合成了siRNA，并將其成功地轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞，RT-PCR和western blot都顯示我們設(shè)計(jì)的siRNA能顯著干擾GGCX的表達(dá)，并以siRNA片段2291干擾效率最高，隨后再對干擾了GGCX表達(dá)的軟骨細(xì)胞進(jìn)行檢測分析，結(jié)果顯示:MMP13、X型膠原、堿性磷酸酶的蛋白表達(dá)及mRNA都顯著高于未干擾組及無意義對照組(P＜0.05);干

7、擾了GGCX的軟骨細(xì)胞在早期凋亡率、中晚期凋亡率及總凋亡率方面均明顯高于未干擾組及無意義對照組(P＜0.05);軟骨細(xì)胞干擾組、無意義對照干擾組在0、12、24小時(shí)的細(xì)胞增殖率相對正常培養(yǎng)組沒有明顯升高(P＞0.05)，但干擾GGCX表達(dá)的軟骨細(xì)胞在48、72小時(shí)的增殖率顯著升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、原發(fā)性膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的軟骨中GGCX的表達(dá)較正常軟骨顯著降低，并且軟骨退變程度越重，GGCX表達(dá)亦越低;<