人類原發(fā)性膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎病變軟骨全基因組表達(dá)與分析.pdf

1、原發(fā)性膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（KOA）是一種隨年齡增長(zhǎng)而發(fā)生率明顯增加的退行性關(guān)節(jié)疾病，是老年人關(guān)節(jié)疼痛和致殘的主要原因。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，骨性關(guān)節(jié)炎在女性患病率中占第四位。隨年齡增大，患病率迅速上升，大于65歲人群中50％以上有骨性關(guān)節(jié)炎的X線片表現(xiàn)。它的主要改變是關(guān)節(jié)軟骨面的退行性變和繼發(fā)性的骨質(zhì)增生。主要表現(xiàn)是關(guān)節(jié)疼痛和活動(dòng)不靈活，X線表現(xiàn)關(guān)節(jié)間隙變窄，軟骨下骨質(zhì)致密，骨小梁斷裂，有硬化和囊性變。關(guān)節(jié)邊緣有唇樣增生。后期骨端

2、變形，關(guān)節(jié)面凹凸不平。關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨剝落，骨質(zhì)碎裂進(jìn)入關(guān)節(jié)，形成關(guān)節(jié)內(nèi)游離體。
　　 KOA按病因可分為原發(fā)性KOA和繼發(fā)性KOA。原發(fā)性KOA是指用目前所有的檢查方法查不出病因的骨關(guān)節(jié)炎，通常所指的骨關(guān)節(jié)炎屬于這一類；繼發(fā)性KOA是指在其它各種病因或疾病的基礎(chǔ)上，誘發(fā)的病變，如創(chuàng)傷、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)及內(nèi)分泌疾病等。這一類骨關(guān)節(jié)炎的病變比較局限，不伴發(fā)赫伯登結(jié)節(jié)。反復(fù)使關(guān)節(jié)勞損的人群是患骨關(guān)節(jié)炎的高危人群，如鑄造工人、礦工和公共汽

3、車司機(jī)等。但是進(jìn)行長(zhǎng)跑鍛煉的人卻不是患本病的高危人群。肥胖是造成骨關(guān)節(jié)炎的主要因素，但目前證據(jù)尚不充分。按照部位可分為局灶性KOA和全身性KOA，按照是否有臨床癥狀可分為無(wú)癥狀性KOA和癥狀性KOA。臨床工作中遇到的KOA大多是癥狀性KOA。主要侵害關(guān)節(jié)軟骨和滑膜組織，導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛、畸形和功能障礙，從而影響患者的活動(dòng)能力。正常情況下，關(guān)節(jié)之間摩擦力很小不會(huì)造成磨損，除非過(guò)度使用或損傷。造成骨關(guān)節(jié)炎的最可能原因是合成軟骨成分的異常，如膠原

4、（是一種堅(jiān)韌的、結(jié)締組織中的纖維蛋白）和粘蛋白（一種產(chǎn)生軟骨彈性的物質(zhì)）的異常。另外，軟骨雖然生長(zhǎng)旺盛，但是很薄，其表面很容易發(fā)生破裂。關(guān)節(jié)邊緣的骨過(guò)度生長(zhǎng)，形成可以看見(jiàn)和摸到的包塊（稱為骨贅）。骨贅引起關(guān)節(jié)面不平，干擾正常關(guān)節(jié)的功能，引起疼痛。
　　 該病從關(guān)節(jié)軟骨起病，影響整個(gè)關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)，包括軟骨下骨、韌帶、滑膜、關(guān)節(jié)囊及關(guān)節(jié)外肌肉，最終因關(guān)節(jié)軟骨全部脫失而導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失的一種疾病。
　　 關(guān)節(jié)軟骨是其發(fā)病機(jī)制

5、重要因素之一，關(guān)節(jié)軟骨是由1-2mm厚度膠原纖維、糖蛋白、透明質(zhì)酸酯聚集而成，當(dāng)水合作用時(shí)就起了墊子樣作用，以吸收和分散所承受的負(fù)重和機(jī)械力量。在生理狀況下，關(guān)節(jié)軟骨依靠關(guān)節(jié)周圍及熱的收縮及軟骨下的骨質(zhì)來(lái)完全上述的任務(wù)。肌肉的收縮除帶動(dòng)關(guān)節(jié)活動(dòng)外，同時(shí)起著橡皮帶樣作用，吸收了大量傳來(lái)的沖力，保護(hù)了關(guān)節(jié)。當(dāng)發(fā)生意外（如摔跤）時(shí)，因?yàn)榧∪鈱?duì)此突發(fā)的震動(dòng)不能及時(shí)出現(xiàn)保護(hù)性反應(yīng)而使關(guān)節(jié)負(fù)重加重，可致致害關(guān)節(jié)損傷，因此肌肉對(duì)此突突發(fā)的震動(dòng)不能及時(shí)

6、出現(xiàn)保護(hù)性反映而使關(guān)節(jié)負(fù)重加重，可致關(guān)節(jié)損傷。此外，肌肉老化、周圍神經(jīng)病變時(shí)，肌肉吸收能量的功能也大大的減弱。協(xié)助軟骨承負(fù)重的另一因素是軟骨下呈現(xiàn)網(wǎng)狀分布的骨質(zhì)量，其質(zhì)地雖較軟骨應(yīng)但比骨皮質(zhì)軟，故具有高度彈性，有利于承受壓力?？梢钥闯龉切躁P(guān)節(jié)炎多出新在以下兩種情況：一是關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下皮質(zhì)地、關(guān)節(jié)周圍肌肉有異常時(shí)，如老年性退行性變、骨質(zhì)疏松、炎癥、代謝性疾病等：二是關(guān)節(jié)軟骨、關(guān)節(jié)下骨質(zhì)、關(guān)節(jié)周圍肌肉雖正常但因承受了過(guò)度性壓力，如肥胖、外

7、傷等。
　　 中醫(yī)藥治療膝骨性關(guān)節(jié)炎有著豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)與獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。隨著中醫(yī)藥治療膝骨性關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)研究的不斷深入，對(duì)于中醫(yī)藥治療膝關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)，已經(jīng)從簡(jiǎn)單的組織形態(tài)學(xué)分析發(fā)展到免疫組織化學(xué)、分子生物學(xué)等多學(xué)科、多層次、多環(huán)節(jié)的認(rèn)識(shí)。近年來(lái)，各種實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎的影響主要表現(xiàn)在膝骨性關(guān)節(jié)炎的組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞因子、骨內(nèi)壓、氧自由基等方面。
　　 KOA的診斷通常是依靠臨床表現(xiàn)和放射線檢查。其簡(jiǎn)單的診斷

8、依據(jù)是：
　　 1、癥狀：
　　 ①疼痛：運(yùn)動(dòng)時(shí)疼痛主要由機(jī)械性或肌腱、韌帶接頭病所致；休息時(shí)疼痛為炎癥所致。夜間痛提示骨內(nèi)壓增高，為病情嚴(yán)重和預(yù)后不良指征。
　　 ②僵硬：見(jiàn)于關(guān)節(jié)不活動(dòng)之后，但一般持續(xù)時(shí)間不長(zhǎng)。
　　 ③其他癥狀如關(guān)節(jié)腫脹、畸形和關(guān)節(jié)彈響等。
　　 2、體征：關(guān)節(jié)活動(dòng)響聲，骨肥大，不同程度的滑膜炎可致壓痛，腱反射異常，肌無(wú)力等。嚴(yán)重病例可見(jiàn)功能障礙甚至殘廢。
　　 3、

9、觀察病人行走、彎腰和進(jìn)行日?；顒?dòng)的能力。
　　 4、影象學(xué)檢查：包括X線、CT和MRI檢查。
　　 5、其他檢查：血液檢查、關(guān)節(jié)液檢查和關(guān)節(jié)鏡檢查等。
　　 然而，在KOA的早期并不能通過(guò)放射線檢查發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨的變化，因?yàn)樵诜派渚€檢查能夠發(fā)現(xiàn)軟骨有改變之前，軟骨一定在分子代謝和超微結(jié)構(gòu)上發(fā)生了非常顯著的變化。
　　 在原發(fā)性KOA的臨床研究和實(shí)驗(yàn)研究中雖然作出了很多努力，研究表明關(guān)節(jié)滑膜和關(guān)節(jié)軟骨在原發(fā)性

10、KOA發(fā)病中起主導(dǎo)作用，但是其發(fā)病機(jī)制仍然不十分明了，目前多采取手術(shù)和對(duì)癥治療為主。
　　 研究目的：本項(xiàng)研究以關(guān)節(jié)軟骨為研究對(duì)象，目的在于通過(guò)全基因組基因譜的表達(dá)，研究與本病相關(guān)的全部差異表達(dá)基因，從而進(jìn)一步探討軟骨差異表達(dá)基因與本病的相關(guān)性，尋找治療本病的新靶點(diǎn)和新方法。同時(shí)，對(duì)部分差異基因進(jìn)行復(fù)孔的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，進(jìn)一步驗(yàn)證所獲得的差異基因在原發(fā)性KOA病理過(guò)程中的意義。
　　 研究方法：
　　 材料：

11、本研究共采集16例人膝關(guān)節(jié)軟骨樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)，原發(fā)性KOA病人12例，實(shí)驗(yàn)用軟骨全部在膝關(guān)節(jié)鏡手術(shù)和人工膝關(guān)節(jié)置換術(shù)中獲得。并根據(jù)Kellgren和Laurence放射學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，疾病組將每4個(gè)病人的軟骨樣本分為一組，分為輕（R2）、中（R3）、重（R4）三組；將4例健康人的膝關(guān)節(jié)軟骨樣本為健康組（RB1）。
　　 方法:
　　 1、對(duì)上述16例軟骨樣本分別進(jìn)行全基因組芯片分析，在每張芯片上所擁有的

12、40000個(gè)點(diǎn)上檢測(cè)出16例樣本所共同擁有的基因表達(dá)。
　　 2、按照預(yù)先的分組，在共有基因范圍內(nèi)，對(duì)每個(gè)組內(nèi)每個(gè)對(duì)應(yīng)基因運(yùn)算其均量，將每組樣本轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€(gè)個(gè)體（R2、R3、R4、RB1四組），進(jìn)行組間比較。
　　 3、RNA樣品制備
　　 1）兩相分離；2）RNA沉淀；3）RNA清洗；4）重新溶解RNA沉淀；5）RNA質(zhì)量檢測(cè)。
　　 4、aRNA樣品標(biāo)記和合成
　　 1）cDNA合成；2）cDN

13、A第二鏈合成；3）aRNA合成；4）aRNA純化；5）aa-UTP aRNA間接標(biāo)記；6）質(zhì)量控制。
　　 5、芯片預(yù)雜交。
　　 6、雜交。
　　 7、洗片。
　　 8、結(jié)果掃描，數(shù)據(jù)讀取。
　　 9、合成的cDNA用于實(shí)時(shí)定量PCR。
　　 10、進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)。
　　 研究結(jié)果:
　　 1、通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)，在16例樣本共有基因范圍內(nèi)，鑒定出很多差異表達(dá)

14、的基因，而具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異基因共70個(gè)，其中：上調(diào)3倍以上的基因46個(gè)，其中已知基因28個(gè)，未知基因18個(gè)。已知基因中，上調(diào)4倍以上的基因25個(gè)，上調(diào)5倍以上的基因15個(gè)，上調(diào)6倍以上的基因11個(gè)，上調(diào)7倍以上的基因8個(gè)，上調(diào)8倍以上的基因3個(gè)；下調(diào)3倍以上的基因24個(gè)，其中已知基因16個(gè)，未知基因8個(gè)。已知基因中，下調(diào)4倍以上的基因11個(gè)，下調(diào)5倍以上的基因8個(gè)，下調(diào)6倍以上的基因6個(gè)，下調(diào)7倍以上的基因6個(gè)，下調(diào)8倍以上的基因2

15、個(gè)。
　　 2、上調(diào)3倍以上的差異基因包括：參與軟骨分解代謝的基因及具有免疫功能的基因。
　　 3、下調(diào)3倍以上的差異基因包括：參與軟骨合成代謝的基因及具有信息傳遞功能的基因。
　　 4、在70個(gè)差異表達(dá)基因中任意選定10個(gè)差異基因，又進(jìn)行了復(fù)孔的PCR實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，通過(guò)三次的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，三次的結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著差異。
　　 5、R2與R3、R3與R4、R2與R4比較發(fā)現(xiàn)，上調(diào)或下調(diào)3倍以上差異基因在骨