抗菌肽17BIPHE2抑制金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌生物被膜作用的研究.pdf

1、目的：
　　研究抗菌肽17BIPHE2單獨(dú)使用及聯(lián)合抗生素對金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)和銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)生物被膜的抑制作用，并初步探討抗菌肽17BIPHE2作用細(xì)菌后對生物被膜相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，為治療金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌生物被膜相關(guān)感染及藥物研發(fā)提供了一個(gè)新思路。
　　方法：
　　1.采用剛果紅平板測試法（金黃色葡萄

2、球菌）和結(jié)晶紫染色法評估受試菌形成生物被膜的能力；
　　2.微量肉湯稀釋法和瓊脂平板測試法測定金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌最小抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)；
　　3.利用生物被膜早期黏附實(shí)驗(yàn)觀察17BIPHE2單獨(dú)使用及聯(lián)合抗生素對生物被膜黏附階段的影響；
　　4.利用生物被膜形成抑制實(shí)驗(yàn)觀察17BIPHE2單獨(dú)使用及聯(lián)合抗生素對生物被膜形成階段的影響；
　　5.通過掃描電子顯微鏡(SEM)觀察17

3、BIPHE2單獨(dú)使用及聯(lián)合抗生素是否具有清除成熟階段生物被膜的作用；
　　6.采用激光共聚焦激光掃描顯微鏡（LSCM）觀察17BIPHE2是否具有殺傷成熟銅綠假單胞菌生物被膜內(nèi)細(xì)菌的作用；
　　7.利用Real-Time PCR分析17BIPHE2作用細(xì)菌后對生物被膜相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)剛果紅平板測試法和結(jié)晶紫染色法評估臨床分離株SA05具有較強(qiáng)形成生物被膜能力，臨床分離株SA07不具

4、有形成生物被膜的能力；經(jīng)結(jié)晶紫染色法評估臨床分離株P(guān)A03具有較強(qiáng)的形成生物被膜能力，臨床分離株P(guān)A07不具有形成生物被膜的能力；
　　2.17BIPHE2對金黃色葡萄球菌MIC值為8μmol/L，1/2×MIC就可以有效抑制浮游菌的生長。17BIPHE2對銅綠假單胞菌MIC值為48μmol/L，亞抑菌濃度也可以有效抑制浮游菌的生長。17BIPHE2聯(lián)合抗生素使用較單一使用MIC值均有所下降；
　　3.單獨(dú)使用17BIPHE

5、2在金黃色葡萄球菌黏附階段抑制率為40%，17BIPHE2聯(lián)合抗生素使用較單獨(dú)使用抗生素其抑制效果有所提升。單獨(dú)使用17BIPHE2在銅綠假單胞菌黏附階段抑制率為60%，17BIPHE2聯(lián)合抗生素使用與上述結(jié)果相似，較單獨(dú)使用抗生素抑制率有所提高；
　　4.在金黃色葡萄球菌生物被膜形成階段17BIPHE2單獨(dú)使用抑制率達(dá)到35%，而在銅綠假單胞菌生物被膜形成階段17BIPHE2單獨(dú)使用抑制率達(dá)到80%。值得注意的是，17BIPHE

6、2在1/4×MIC也可以顯著抑制兩種細(xì)菌產(chǎn)生生物被膜。17BIPHE2聯(lián)合抗生素結(jié)果顯示較單獨(dú)使用抗生素其抑制生物被膜產(chǎn)生能力均有所提高；
　　5.經(jīng)掃描電子顯微鏡觀察，17BIPHE2在1/4×MIC濃度即可促進(jìn)金黃色葡萄球菌成熟生物被膜消散，1×MIC生物被膜消散同時(shí)細(xì)菌黏附量有所下降，聯(lián)合萬古霉素促進(jìn)生物被膜消散同時(shí)細(xì)菌胞質(zhì)大量外泄。17BIPHE2促進(jìn)銅綠假單胞菌成熟生物被膜消散效果與上述結(jié)果相似，亞抑菌濃度即可促進(jìn)銅綠假

7、單胞菌生物被膜消散；隨著藥物濃度提高細(xì)菌黏附量急劇下降，并且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。當(dāng)17BIPHE2濃度達(dá)到1×MIC時(shí)細(xì)菌完整形態(tài)幾乎消失，生物被膜消散同時(shí)細(xì)胞質(zhì)外泄；抗菌肽聯(lián)合環(huán)丙沙星清除生物被膜作用尤為顯著；
　　6.采用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察單獨(dú)17BIPHE2處理銅綠假單胞菌生物被膜后發(fā)現(xiàn)，隨著藥物濃度的提高，細(xì)菌黏附量逐漸下降，死菌數(shù)逐漸增多，并且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系。當(dāng)抗菌肽濃度提升至1×MIC，活菌數(shù)和死菌數(shù)均明顯

8、下降。17BIPHE2聯(lián)合抗生素處理組較單獨(dú)使用抗生素處理組細(xì)菌黏附量顯著下降，殺菌作用明顯提高；
　　7.Real-Time PCR結(jié)果表明，隨著17BIPHE2濃度提高，金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌生物被膜相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量均出現(xiàn)不同程度的抑制，且高濃度處理組抑制作用更為明顯。
　　結(jié)論：
　　抗菌肽17BIPHE2具有良好的抑制金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌生物被膜黏附、聚集作用，并可促進(jìn)成熟生物被膜消散。1