豬三種細(xì)胞因子免疫增強(qiáng)作用和山羊四種抗血清抑制細(xì)胞因子活性分析.pdf

1、細(xì)胞因子是由機(jī)體免疫細(xì)胞和免疫相關(guān)細(xì)胞分泌的一類高活性多功能蛋白質(zhì)類物質(zhì)，是細(xì)胞間的信號傳遞分子，調(diào)節(jié)和介導(dǎo)著體內(nèi)的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，是機(jī)體免疫學(xué)功能發(fā)揮的必要成分。IL-2、IL-4、IL-18和IFN-γ都是機(jī)體免疫應(yīng)答不可缺少的成分，因其具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用而成為免疫佐劑研究的熱點。本研究對豬重組IL-2、IL-4和IFN-γ進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)而開展了對口蹄疫合成肽疫苗免疫增強(qiáng)作用的研究，為細(xì)胞因子佐劑的臨床應(yīng)用提供了試驗依據(jù)

2、;又對山羊重組IL-2、IL-4、IL-18和IFN-γ進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，并進(jìn)行了各重組蛋白的生物學(xué)活性檢測和相應(yīng)抗血清抑制蛋白活性的研究。
　　1.豬重組IL-2、IL-4和IFN-γ原核表達(dá)和生物學(xué)活性檢測
　　對含有pET28a-IL-2、pET32a-IL-4和pET28a-IFN-γ重組質(zhì)粒的Rosetta2陽性克隆菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分別表達(dá)了相對分子量為21.4kDa、30.3kDa和20.7kDa的重組蛋白，并對包

3、涵體蛋白進(jìn)行了純化和復(fù)性。通過CCK-8法檢測了重組蛋白IL-2和IL-4對豬外周血淋巴細(xì)胞的增殖活性，并利用VSV/PK15系統(tǒng)檢測了重組蛋白IFN-γ的抗病毒活性。結(jié)果顯示豬重組蛋白IL-2能顯著刺激外周血淋巴的增殖，并表現(xiàn)出一定的劑量依賴性，在蛋白濃度為10μg/mL時刺激效應(yīng)最強(qiáng)，但當(dāng)超過10μg/mL時刺激增殖效應(yīng)開始減弱;重組蛋白IL-4不能有效刺激淋巴細(xì)胞的增殖，增殖效應(yīng)較弱;重組蛋白IFN-γ能有效抑制VSV在PK15細(xì)

4、胞上的復(fù)制，具有良好的抗病毒作用，其抗VSV活性為1.135×104U/mg。
　　2.豬重組IL-2、IL-4和IFN-γ對口蹄疫合成膚疫苗的免疫增強(qiáng)作用研究
　　分別將原核表達(dá)的豬重組IL-2、IL-4和IFN-γ蛋白以15μg/kg劑量與口蹄疫合成肽疫苗配伍免疫仔豬，并設(shè)空白對照組(PBS)、口蹄疫疫苗對照組、空載體蛋白對照組，檢測仔豬抗口蹄疫抗體水平和血清細(xì)胞因子IL-4、IL-10、IL-17和IFN-γ含量的變化

5、，觀察其免疫佐劑效應(yīng)。結(jié)果表明:制備的IL-2、IL-4和IFN-γ重組蛋白均有較好的生物學(xué)活性，其中IL-2和IFN-γ重組蛋白均能顯著提高仔豬抗口蹄疫抗體水平(P＜0.01)，而IL-4重組蛋白抑制口蹄疫抗體的產(chǎn)生(P＜0.01）。血清細(xì)胞因子檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)疫苗+IL-4組的IL-4和IL-10含量均較疫苗對照組顯著升高(P＜0.05），疫苗+IL-2組及疫苗+IFN-γ組的IFN-γ含量較疫苗對照組極顯著升高(P＜0.01)。結(jié)果提

6、示，重組細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ分別作為免疫佐劑與口蹄疫疫苗配伍使用，能顯著增強(qiáng)機(jī)體的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。
　　3.山羊重組IL-2、IL-4、IL-18和IFN-γ抗血清抑制重組蛋白活性分析
　　將含pET32a-IL-2、pET32a-IL-4、pET28a-IL-18和pET32a-IFN-γ重組質(zhì)粒的BL21陽性克隆菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，分別表達(dá)了相對分子量為35.6kDa、30.7kDa、37.3kDa和22.

7、3kDa的重組蛋白，并對表達(dá)的包涵體蛋白進(jìn)行了純化和復(fù)性。利用CCK-8法檢測了重組蛋白IL-2、IL-4和IL-18對山羊外周血淋巴細(xì)胞的增殖活性，通過巨噬細(xì)胞吞噬功能和硝酸還原酶法檢測了IL-18對鼠腔來源巨噬細(xì)胞吞噬中性紅和分泌NO能力的影響，并利用VSV/PK15系統(tǒng)檢測了IFN-γ重組蛋白的抗病毒活性，接著進(jìn)行相應(yīng)抗血清抑制上述重組蛋白活性的檢測。結(jié)果表明山羊重組蛋白IL-2、IL-4和IL-18能顯著刺激山羊外周血淋巴細(xì)胞的

8、增殖，并表現(xiàn)出一定的劑量依賴性，三種重組蛋白分別在5μg/mL、25μg/mL和4μg/mL時刺激效應(yīng)最強(qiáng);IL-18對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅和分泌NO能力的影響也與其劑量密切相關(guān)，在適宜的濃度范圍內(nèi)隨蛋白劑量增加而能力增強(qiáng)，在IL-18濃度為0.25μg/mL時巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力最強(qiáng)，在IL-18濃度為1μg/mL時分泌NO能力最強(qiáng)。山羊重組IFN-γ具有較好的抗病毒作用，其抗VSV活性為2.52×104U/mg?？寡宸忾]試