JAZF1基因抑制對(duì)糖脂代謝及相關(guān)信號(hào)通路的影響.pdf

1、第一部分:構(gòu)建及篩選鑒定小鼠JAZF1-shRNA真核表達(dá)載體。
　　目的：構(gòu)建小鼠JAZF1-shRNA表達(dá)載體并構(gòu)建JAZF1基因下調(diào)細(xì)胞模型，為下一步研究JAZF1抑制條件下的糖脂代謝提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：針對(duì)小鼠JAZF1基因序列設(shè)計(jì)合成3條shRNA序列，載體為pGenesil-1-2，啟動(dòng)子選擇為mU6，構(gòu)建pGenesil-JAZF1抑制質(zhì)粒1，2，3。轉(zhuǎn)染小鼠Hepal-6細(xì)胞，運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)篩選

2、最佳抑制質(zhì)粒，隨后轉(zhuǎn)染小鼠3T3-11細(xì)胞，對(duì)抑制效率進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建了3條pGenesil-JAZF1重組質(zhì)粒，其中pGenesil-JAZF1-3號(hào)抑制質(zhì)粒篩選為最佳抑制片段。成功構(gòu)建JAZF1基因表達(dá)下調(diào)細(xì)胞膜型，在hepal-6細(xì)胞中抑制率為78-84％；在轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞，其表達(dá)顯著低于空白對(duì)照約57.3％。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建JAZF1-shRNA表達(dá)載體，篩選出抑制效果最佳的

3、質(zhì)粒，并構(gòu)建JAZF1基因下調(diào)細(xì)胞模型。
　　第二部分: JAZF1基因抑制對(duì)脂肪細(xì)胞和肝細(xì)胞糖脂代謝的影響
　　目的：在JAZF1基因表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞模型基礎(chǔ)上，探討JAZF1基因抑制對(duì)脂肪細(xì)胞及肝細(xì)胞糖脂代謝的影響。
　　方法：小鼠脂肪細(xì)胞及肝細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染最佳抑制效率的pGenesil-JAZF1-3號(hào)質(zhì)粒，應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞糖代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)，Western blot法及細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)兩種細(xì)胞糖脂代謝相關(guān)

4、蛋白表達(dá)的影響。細(xì)胞糖代謝指標(biāo)的mRNA水平變化采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)，脂肪細(xì)胞甘油三酯含量變化用油紅O染色半定量檢測(cè)，運(yùn)用氫三放射示蹤法檢測(cè)脂肪細(xì)胞糖攝取率。
　　結(jié)果：在肝細(xì)胞中，糖代謝相關(guān)基因GLUT1和GLLIT4 mRNA表達(dá)下降(P<0.05)，GLUT1蛋白表達(dá)升高但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，G-6-Pase蛋白表達(dá)降低但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，PEPCK蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；脂代謝相關(guān)基因HSL蛋白表達(dá)降低，PPAR-γ

5、蛋白表達(dá)升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在脂肪細(xì)胞中，糖代謝相關(guān)基因GLUT1和GLUT4 mRNA表達(dá)下降(P<0.05)，GLUT1和GLUT4蛋白表達(dá)升高但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；脂代謝相關(guān)基因HSL表達(dá)降低(P<0.05)，PPAR-γ表達(dá)升高(P<0.05)；細(xì)胞因子Visfatin和脂聯(lián)素蛋白表達(dá)均下降(P<0.05)；膽固醇代謝相關(guān)基因Insig-2蛋白表達(dá)下降(P<0.05)。
　　結(jié)論：JAZF1基因抑制可減少基礎(chǔ)糖轉(zhuǎn)運(yùn)，增加脂質(zhì)與

6、膽固醇合成，減少脂質(zhì)分解并減少相關(guān)脂肪細(xì)胞因子的表達(dá)。
　　第三部分 :JAZF1基因抑制對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的影響
　　目的：通過對(duì)糖脂代謝相關(guān)信號(hào)通路變化的研究，進(jìn)一步明確JAZF1基因抑制對(duì)細(xì)胞糖脂代謝的影響機(jī)制。
　　方法：運(yùn)用Western blot技術(shù)檢測(cè)兩種細(xì)胞糖脂代謝相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：在肝細(xì)胞中，JAZF1抑制條件下的AKT和AMPK的磷酸化差異不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在脂肪細(xì)胞中，