肺纖維化形成中大鼠肺內(nèi)肥大細胞結(jié)締組織生長因子表達的變化及其機制初探.pdf

1、目的：肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是以肺成纖維細胞大量增殖和肺內(nèi)膠原異常堆積為特征的進行性間質(zhì)性肺疾病。研究發(fā)現(xiàn)，在博萊霉素(bleomycin，BLM)誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化形成過程中，大鼠肺內(nèi)肥大細胞(mast cells，MCs)數(shù)目增多。本課題組以往研究發(fā)現(xiàn)，大鼠氣管內(nèi)滴注BLM第14天和第28天肺內(nèi)MCs增多，在肺連續(xù)切片上發(fā)現(xiàn)MCs分泌結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth

2、factor，CTGF)。但此發(fā)現(xiàn)尚需進一步證實。迄今MCs分泌CTGF的機制尚不清楚。類胰蛋白酶是MCs的特異性標志物。本實驗首先用類胰蛋白酶免疫顯色方法證實肺纖維化形成過程中肺內(nèi)MCs數(shù)量的增多；并用免疫熒光雙標的方法證實MCs表達CTGF；在此基礎(chǔ)上，通過觀察氨基胍(aminoguanidine，AG)和黃芩苷(Baicalin，Bai)對肺纖維化形成過程中大鼠肺內(nèi)MCs數(shù)量以及表達CTGF的影響，以期闡明肺纖維化形成過程中肺內(nèi)M

3、Cs數(shù)量增多的機制以及MCs表達CTGF的機制。
　　方法：免疫組化方法檢測MCs的數(shù)量；免疫熒光雙標的方法驗證MCs表達CTGF；用HE染色觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化。
　　將52只健康清潔級Sprague-Dawley(SD)(♂)(體重170-180 g)大鼠隨機分成三組：1.動態(tài)觀察組(n=8)：分兩個時間點即14d和28d大鼠于氣管內(nèi)一次性滴注BLM(5 mg/kg)或NS(0.5 ml/kg)后第15d和29d被處死取

4、肺。2.早期給藥組(即1-14d給藥組)(n=21)：14dNS+14dNS大鼠(n=3)于氣管內(nèi)一次性滴注NS(0.5 ml/kg)后，每天腹腔注射NS(1 ml/kg)，連續(xù)14d；14dM+14dNS大鼠(n＝8)于氣管內(nèi)一次性滴注BLM(5 mg/kg)后，每天腹腔注射NS(1 ml/kg)，連續(xù)14d；14dM+14dBai大鼠(n=5)于氣管內(nèi)一次性滴注BLM(5 mg/kg)后，每天腹腔注射Bai(12.5 mg/kg)，

5、連續(xù)14d；14dM+14dAG大鼠(n=5)于氣管內(nèi)一次性滴注BLM(5 mg/kg)后，每天腹腔注射AG(20 mg/kg)，連續(xù)14d。此組大鼠于第15d取肺。3.晚期給藥組(即14-28d給藥)(n=23)：28dNS+后14dNS大鼠(n=3)于氣管內(nèi)一次性滴注NS(0.5 ml/kg)后第14d至28d期間，每天腹腔注射NS(1 ml/kg)；28dM+后14dNS大鼠(n=8)于氣管內(nèi)一次性滴注BLM(5 mg/kg)后第

6、14d至28d期間，每天腹腔注射NS(1 ml/kg)；28dM+后14dBai大鼠(n=6)于氣管內(nèi)一次性滴注BLM(5mg/kg)后第14d至28d期間，每天腹腔注射Bai(12.5 mg/kg)；28dM+后14dAG大鼠(n=6)于氣管內(nèi)一次性滴注BLM(5 mg/kg)后第14d至28d期間，每天腹腔注射AG(20 mg/kg)。此組大鼠于第29d取肺。以上各組大鼠均在規(guī)定的時間點取肺，肺組織用于檢測MCs及CTGF免疫陽性的

7、MCs數(shù)量和形態(tài)學(xué)觀察。
　　采用人工計數(shù)法，每張免疫組化切片隨機選取5個高倍不重疊視野準確計數(shù)MCs，每只大鼠計數(shù)肺組織不同部位3張切片計算MCs的平均值。每張免疫熒光組化切片隨機選取3個低倍不重疊視野準確計數(shù)MCs及CTGF免疫陽性的MCs數(shù)量，每只大鼠計數(shù)肺組織不同部位3張切片計算MCs及CTGF免疫陽性的MCs數(shù)量的平均值。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差(-x±SD)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，多個樣本均數(shù)比較用單因素方

8、差分析(One-way ANOVA)，多個樣本均數(shù)間的兩兩比較用最小顯著差法(Least significant difference，LSD)，以P<0.05為有顯著性差異。
　　結(jié)果：
　　1肺纖維化形成中肺內(nèi)MCs及CTGF免疫陽性的MCs數(shù)量的變化
　　1.1 MCs數(shù)量的動態(tài)變化：免疫組化和免疫熒光顯色結(jié)果顯示：與對照組大鼠相比，BLM大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶免疫陽性染色的MCs數(shù)量第14天和第28天增多(P<0.

9、01，P<0.001)。與14dM大鼠相比，28dM大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶免疫陽性染色的MCs數(shù)量的變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　1.2類胰蛋白酶與CTGF共存的MCs數(shù)量的動態(tài)變化：與對照組大鼠相比，BLM大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶與CTGF共存的MCs數(shù)量在第14天和第28天增多(P<0.001)。與14dM大鼠相比，28dM大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶與CTGF共存的MCs數(shù)量的變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組大鼠相比，14d

10、M和28dM大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶與CTGF共存的MCs占肺內(nèi)總MCs的百分比略有增加，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與14dM大鼠相比，28dM大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶與CTGF共存的MCs占肺內(nèi)總MCs的百分比的變化無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　2 AG和Bai對肺纖維化形成早期(1-14d)肺內(nèi)MCs及CTGF免疫陽性的MCs數(shù)量的影響
　　2.1早期肺內(nèi)MCs數(shù)量的變化：免疫組化和免疫熒光顯色結(jié)果顯示：與14dNS+1

11、4dNS大鼠相比，14dM+14dNS大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶免疫陽性染色的MCs數(shù)量明顯增多(P<0.001)。與14dM+14dNS大鼠相比，14dM+14dAG和14dM+14dBai大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶免疫陽性染色的MCs數(shù)量明顯減少(P<0.001，P<0.01)。
　　2.2早期肺內(nèi)類胰蛋白酶與CTGF共存的MCs數(shù)量的變化：與14dNS+14dNS大鼠相比，14dM+14dNS大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶與CTGF共存的MCs數(shù)量增多

12、(P<0.001)。與14dM+14dNS大鼠相比，14dM+14dAG和14dM+14dBai大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶與CTGF共存的MCs數(shù)量減少(P<0.01)。與14dNS+14dNS大鼠相比，14dM+14dNS大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶與CTGF共存的MCs占肺內(nèi)總MCs的百分比略有增多，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與14dM+14dNS大鼠相比，14dM+14dAG和14dM+14dBai大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶與CTGF共存的MCs占肺

13、內(nèi)總MCs的百分比略微減少，但統(tǒng)計學(xué)無顯著性意義(P>0.05)。
　　3 AG和Bai對肺纖維化形成晚期(14-28d)肺內(nèi)MCs及CTGF免疫陽性MCs數(shù)量的影響
　　3.1晚期肺內(nèi)MCs數(shù)量的變化：免疫組化和免疫熒光顯色結(jié)果顯示：與28dNS+后14dNS大鼠相比，28dM+后14dNS大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶免疫陽性染色的MCs數(shù)量明顯增多(P<0.001)。與28dM+后14dNS大鼠相比，28dM+后14dAG和28d

14、M+后14dBai大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶免疫陽性染色的MCs數(shù)量明顯減少(P<0.001，P<0.01)。
　　3.2晚期肺內(nèi)類胰蛋白酶與CTGF共存的MCs數(shù)量的變化：與28dNS+后14dNS大鼠相比，28dM+后14dNS大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶與CTGF共存的MCs數(shù)量增多(P<0.01)。與28dM+后14dNS大鼠相比，28dM+后14dAG和28dM+后14dBai大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶與CTGF共存的MCs數(shù)量減少(P<0.01

15、)。與28dNS+后14dNS大鼠相比，28dM+后14dNS大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶與CTGF共存的MCs占肺內(nèi)總MCs的百分比增多(P<0.05)。與28dM+后14dNS大鼠相比，28dM+后14dAG和28dM+后14dBai大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶與CTGF共存的MCs占肺內(nèi)總MCs的百分比略微減少，但統(tǒng)計學(xué)無顯著性意義(P>0.05)。
　　4 AG和Bai對肺纖維化形成早期和晚期肺組織形態(tài)學(xué)(HE染色)的影響
　　4.1肺

16、纖維化形成過程中肺組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果：14dNS和28dNS大鼠肺結(jié)構(gòu)正常，無炎癥表現(xiàn)。14dM和28dM大鼠肺泡腔充滿大量炎細胞，肺間隔增寬，局部有肺實變。
　　4.2早期肺組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果：14dNS+14dNS大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，無炎癥表現(xiàn)。14dM+14dNS大鼠肺間隔明顯增寬。與14dM+14dNS大鼠相比，14dM+14dAG和14dM+14dBai大鼠上述形態(tài)學(xué)改變明顯減輕。
　　4.3晚期肺組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)

17、果：28dNS+后14dNS大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，無炎癥表現(xiàn)。28dM+后14dNS大鼠肺間質(zhì)細胞明顯增多，肺泡壁增厚，局部有肺實變。與28dM+后14dNS大鼠相比，28dM+后14dAG和28dM+后14dBai大鼠上述形態(tài)學(xué)改變明顯減輕。
　　結(jié)論：
　　1.在肺纖維化形成過程中，大鼠肺內(nèi)MCs增多，MCs表達CTGF。
　　2.在肺纖維化早期和晚期階段，AG和Bai均可減少模型大鼠肺內(nèi)MCs及CTGF免疫陽性的M