肺纖維化形成中大鼠肺內(nèi)肥大細(xì)胞結(jié)締組織生長(zhǎng)因子表達(dá)的變化及其機(jī)制初探.pdf

1、目的：肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是以肺成纖維細(xì)胞大量增殖和肺內(nèi)膠原異常堆積為特征的進(jìn)行性間質(zhì)性肺疾病。研究發(fā)現(xiàn)，在博萊霉素(bleomycin，BLM)誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化形成過程中，大鼠肺內(nèi)肥大細(xì)胞(mast cells，MCs)數(shù)目增多。本課題組以往研究發(fā)現(xiàn)，大鼠氣管內(nèi)滴注BLM第14天和第28天肺內(nèi)MCs增多，在肺連續(xù)切片上發(fā)現(xiàn)MCs分泌結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth

2、factor，CTGF)。但此發(fā)現(xiàn)尚需進(jìn)一步證實(shí)。迄今MCs分泌CTGF的機(jī)制尚不清楚。類胰蛋白酶是MCs的特異性標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)首先用類胰蛋白酶免疫顯色方法證實(shí)肺纖維化形成過程中肺內(nèi)MCs數(shù)量的增多；并用免疫熒光雙標(biāo)的方法證實(shí)MCs表達(dá)CTGF；在此基礎(chǔ)上，通過觀察氨基胍(aminoguanidine，AG)和黃芩苷(Baicalin，Bai)對(duì)肺纖維化形成過程中大鼠肺內(nèi)MCs數(shù)量以及表達(dá)CTGF的影響，以期闡明肺纖維化形成過程中肺內(nèi)M

3、Cs數(shù)量增多的機(jī)制以及MCs表達(dá)CTGF的機(jī)制。
　　方法：免疫組化方法檢測(cè)MCs的數(shù)量；免疫熒光雙標(biāo)的方法驗(yàn)證MCs表達(dá)CTGF；用HE染色觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化。
　　將52只健康清潔級(jí)Sprague-Dawley(SD)(♂)(體重170-180 g)大鼠隨機(jī)分成三組：1.動(dòng)態(tài)觀察組(n=8)：分兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)即14d和28d大鼠于氣管內(nèi)一次性滴注BLM(5 mg/kg)或NS(0.5 ml/kg)后第15d和29d被處死取

4、肺。2.早期給藥組(即1-14d給藥組)(n=21)：14dNS+14dNS大鼠(n=3)于氣管內(nèi)一次性滴注NS(0.5 ml/kg)后，每天腹腔注射NS(1 ml/kg)，連續(xù)14d；14dM+14dNS大鼠(n＝8)于氣管內(nèi)一次性滴注BLM(5 mg/kg)后，每天腹腔注射NS(1 ml/kg)，連續(xù)14d；14dM+14dBai大鼠(n=5)于氣管內(nèi)一次性滴注BLM(5 mg/kg)后，每天腹腔注射Bai(12.5 mg/kg)，

5、連續(xù)14d；14dM+14dAG大鼠(n=5)于氣管內(nèi)一次性滴注BLM(5 mg/kg)后，每天腹腔注射AG(20 mg/kg)，連續(xù)14d。此組大鼠于第15d取肺。3.晚期給藥組(即14-28d給藥)(n=23)：28dNS+后14dNS大鼠(n=3)于氣管內(nèi)一次性滴注NS(0.5 ml/kg)后第14d至28d期間，每天腹腔注射NS(1 ml/kg)；28dM+后14dNS大鼠(n=8)于氣管內(nèi)一次性滴注BLM(5 mg/kg)后第

6、14d至28d期間，每天腹腔注射NS(1 ml/kg)；28dM+后14dBai大鼠(n=6)于氣管內(nèi)一次性滴注BLM(5mg/kg)后第14d至28d期間，每天腹腔注射Bai(12.5 mg/kg)；28dM+后14dAG大鼠(n=6)于氣管內(nèi)一次性滴注BLM(5 mg/kg)后第14d至28d期間，每天腹腔注射AG(20 mg/kg)。此組大鼠于第29d取肺。以上各組大鼠均在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)取肺，肺組織用于檢測(cè)MCs及CTGF免疫陽性的

7、MCs數(shù)量和形態(tài)學(xué)觀察。
　　采用人工計(jì)數(shù)法，每張免疫組化切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍不重疊視野準(zhǔn)確計(jì)數(shù)MCs，每只大鼠計(jì)數(shù)肺組織不同部位3張切片計(jì)算MCs的平均值。每張免疫熒光組化切片隨機(jī)選取3個(gè)低倍不重疊視野準(zhǔn)確計(jì)數(shù)MCs及CTGF免疫陽性的MCs數(shù)量，每只大鼠計(jì)數(shù)肺組織不同部位3張切片計(jì)算MCs及CTGF免疫陽性的MCs數(shù)量的平均值。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±SD)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，多個(gè)樣本均數(shù)比較用單因素方

8、差分析(One-way ANOVA)，多個(gè)樣本均數(shù)間的兩兩比較用最小顯著差法(Least significant difference，LSD)，以P<0.05為有顯著性差異。
　　結(jié)果：
　　1肺纖維化形成中肺內(nèi)MCs及CTGF免疫陽性的MCs數(shù)量的變化
　　1.1 MCs數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化：免疫組化和免疫熒光顯色結(jié)果顯示：與對(duì)照組大鼠相比，BLM大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶免疫陽性染色的MCs數(shù)量第14天和第28天增多(P<0.

9、01，P<0.001)。與14dM大鼠相比，28dM大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶免疫陽性染色的MCs數(shù)量的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　1.2類胰蛋白酶與CTGF共存的MCs數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化：與對(duì)照組大鼠相比，BLM大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶與CTGF共存的MCs數(shù)量在第14天和第28天增多(P<0.001)。與14dM大鼠相比，28dM大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶與CTGF共存的MCs數(shù)量的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組大鼠相比，14d

10、M和28dM大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶與CTGF共存的MCs占肺內(nèi)總MCs的百分比略有增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與14dM大鼠相比，28dM大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶與CTGF共存的MCs占肺內(nèi)總MCs的百分比的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　2 AG和Bai對(duì)肺纖維化形成早期(1-14d)肺內(nèi)MCs及CTGF免疫陽性的MCs數(shù)量的影響
　　2.1早期肺內(nèi)MCs數(shù)量的變化：免疫組化和免疫熒光顯色結(jié)果顯示：與14dNS+1

11、4dNS大鼠相比，14dM+14dNS大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶免疫陽性染色的MCs數(shù)量明顯增多(P<0.001)。與14dM+14dNS大鼠相比，14dM+14dAG和14dM+14dBai大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶免疫陽性染色的MCs數(shù)量明顯減少(P<0.001，P<0.01)。
　　2.2早期肺內(nèi)類胰蛋白酶與CTGF共存的MCs數(shù)量的變化：與14dNS+14dNS大鼠相比，14dM+14dNS大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶與CTGF共存的MCs數(shù)量增多

12、(P<0.001)。與14dM+14dNS大鼠相比，14dM+14dAG和14dM+14dBai大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶與CTGF共存的MCs數(shù)量減少(P<0.01)。與14dNS+14dNS大鼠相比，14dM+14dNS大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶與CTGF共存的MCs占肺內(nèi)總MCs的百分比略有增多，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與14dM+14dNS大鼠相比，14dM+14dAG和14dM+14dBai大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶與CTGF共存的MCs占肺

13、內(nèi)總MCs的百分比略微減少，但統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著性意義(P>0.05)。
　　3 AG和Bai對(duì)肺纖維化形成晚期(14-28d)肺內(nèi)MCs及CTGF免疫陽性MCs數(shù)量的影響
　　3.1晚期肺內(nèi)MCs數(shù)量的變化：免疫組化和免疫熒光顯色結(jié)果顯示：與28dNS+后14dNS大鼠相比，28dM+后14dNS大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶免疫陽性染色的MCs數(shù)量明顯增多(P<0.001)。與28dM+后14dNS大鼠相比，28dM+后14dAG和28d

14、M+后14dBai大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶免疫陽性染色的MCs數(shù)量明顯減少(P<0.001，P<0.01)。
　　3.2晚期肺內(nèi)類胰蛋白酶與CTGF共存的MCs數(shù)量的變化：與28dNS+后14dNS大鼠相比，28dM+后14dNS大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶與CTGF共存的MCs數(shù)量增多(P<0.01)。與28dM+后14dNS大鼠相比，28dM+后14dAG和28dM+后14dBai大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶與CTGF共存的MCs數(shù)量減少(P<0.01

15、)。與28dNS+后14dNS大鼠相比，28dM+后14dNS大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶與CTGF共存的MCs占肺內(nèi)總MCs的百分比增多(P<0.05)。與28dM+后14dNS大鼠相比，28dM+后14dAG和28dM+后14dBai大鼠肺內(nèi)類胰蛋白酶與CTGF共存的MCs占肺內(nèi)總MCs的百分比略微減少，但統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著性意義(P>0.05)。
　　4 AG和Bai對(duì)肺纖維化形成早期和晚期肺組織形態(tài)學(xué)(HE染色)的影響
　　4.1肺

16、纖維化形成過程中肺組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果：14dNS和28dNS大鼠肺結(jié)構(gòu)正常，無炎癥表現(xiàn)。14dM和28dM大鼠肺泡腔充滿大量炎細(xì)胞，肺間隔增寬，局部有肺實(shí)變。
　　4.2早期肺組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果：14dNS+14dNS大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，無炎癥表現(xiàn)。14dM+14dNS大鼠肺間隔明顯增寬。與14dM+14dNS大鼠相比，14dM+14dAG和14dM+14dBai大鼠上述形態(tài)學(xué)改變明顯減輕。
　　4.3晚期肺組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)

17、果：28dNS+后14dNS大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，無炎癥表現(xiàn)。28dM+后14dNS大鼠肺間質(zhì)細(xì)胞明顯增多，肺泡壁增厚，局部有肺實(shí)變。與28dM+后14dNS大鼠相比，28dM+后14dAG和28dM+后14dBai大鼠上述形態(tài)學(xué)改變明顯減輕。
　　結(jié)論：
　　1.在肺纖維化形成過程中，大鼠肺內(nèi)MCs增多，MCs表達(dá)CTGF。
　　2.在肺纖維化早期和晚期階段，AG和Bai均可減少模型大鼠肺內(nèi)MCs及CTGF免疫陽性的M