結(jié)締組織生長(zhǎng)因子在PCPA抑制野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺內(nèi)ECM重機(jī)制探討.pdf

1、肺動(dòng)脈高壓(PAH)是一種以肺血管構(gòu)型重建為主要病理變化特征的疾病，表現(xiàn)為肺小血管增殖、重塑及原位血栓形成，發(fā)生過程是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。近年來關(guān)于5-HT在肺動(dòng)脈高壓中的作用機(jī)理備受關(guān)注。
　　 5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）是一種重要的血管舒縮因子，與肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生機(jī)制之間存在密切的關(guān)系。研究表明:肺動(dòng)脈高壓患者血漿中5-HT濃度明顯增加。5-HT通過5-羥色胺轉(zhuǎn)

2、運(yùn)體（serotonin transporter,5-HTT）盼作用激活MAPK信號(hào)通路，即Ras-Raf-ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforminggrowth factor-β1，TGF-β1)的上調(diào)。
　　 人類結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor, CTGF)由Bradham等于1991年首次在培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，它屬于即刻早期基因CCN家族（包括C

3、yr61、Cef10和NOV），CTGF作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的下游調(diào)節(jié)因子，可通過TGF-β/smad信號(hào)通路被調(diào)控，CTGF的生物學(xué)作用主要有:①促進(jìn)細(xì)胞增殖，合成膠原，有文獻(xiàn)報(bào)道其在肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病期促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖。CTGF可顯著增加成纖維細(xì)胞中Ⅰ型膠原、整合素和纖連蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，CTGF是TGF-β刺激平滑肌細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)過程中必需的介質(zhì)。②介導(dǎo)細(xì)胞黏附。與連蛋白、層粘連蛋白或Ⅰ型膠原相比，CTGF介導(dǎo)成纖維細(xì)胞黏附具有

4、不同特點(diǎn)。它誘導(dǎo)細(xì)胞持久生成更多絲狀假足和片狀假足，促進(jìn)細(xì)胞伸展，并激活酪氨酸激酶，傳遞細(xì)胞黏附信號(hào);還可促進(jìn)細(xì)胞增殖;參與血管形成中內(nèi)皮細(xì)胞遷移和損傷修復(fù)中肉芽組織生成。③誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。④促進(jìn)血管形成。損傷修復(fù)和纖維化疾病常伴隨ECM沉積和血管形成。
　　 另外，在肺動(dòng)脈高壓大鼠模型中，肺組織的金屬基質(zhì)蛋白酶MMPs明顯增加，資料表明CTGF可提高部分金屬基質(zhì)蛋白酶的水平，尤其以膠原酶-13（matrixmetalloprot

5、einases-13，MMP-13）更為顯著，導(dǎo)致ECM的重構(gòu)。在肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制中肺血管重構(gòu)及右心肥厚的病理改變過程中，均涉及到肺血管平滑肌細(xì)胞過度增殖、凋亡抑制和ECM重構(gòu)等機(jī)制。提示CTGF和MMPs及相關(guān)蛋白可能參與上述的病理過程。
　　 同時(shí)，人骨肉瘤細(xì)胞研究表明:在正常機(jī)體內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nucleartranscription factor-κB，NF-κdB）與核轉(zhuǎn)錄因子-κB抑制蛋白-α相連，以失活形式存

6、在于細(xì)胞質(zhì)中。CTGF可通過整合素作用于IKK-NF-κB信號(hào)通路，使核轉(zhuǎn)錄因子-κB抑制蛋白-α發(fā)生磷酸化而解離，NF-κB激活后可產(chǎn)生大量的IL-1和IL-6等細(xì)胞因子，又可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生ICAM-1、ICAM-2等粘附分子及一氧化氮合酶(NOS)。以上炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子可激發(fā)機(jī)體全身炎癥反應(yīng)綜合癥發(fā)生。
　　 本試驗(yàn)我們采用對(duì)氯苯丙氨酸(p-Chlorophenylalanine，PCPA)阻斷5-HT的合成，PCP

7、A是色胺酸羥化酶(Tryptophan hydroxylase，TPH)抑制劑，而TPH是5-HT合成的限速酶，所以PCPA可阻斷底物色氨酸合成5-HT。并且這種抑制是不可逆的，只能待胞體所合成的TPH運(yùn)送到末梢，才能恢復(fù)合成的功能。
　　 目前CTGF和IKK在野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓模型中的作用機(jī)制未見報(bào)道，同時(shí)PCPA抗肺動(dòng)脈高壓的作用是否與CTGF和IKK及相關(guān)蛋白有關(guān)也未見報(bào)道。因此本試驗(yàn)擬用MCT誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈

8、高壓模型，對(duì)CTGF和IKK及相關(guān)蛋白表達(dá)水平及在藥物PCPA干預(yù)的肺動(dòng)脈高壓作用機(jī)制進(jìn)行相關(guān)研究，為PAH病情的治療尋求新的突破。
　　 實(shí)驗(yàn)材料與方法：
　　 一、建立MCT誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠模型
　　 體重170±10g的雄性Wistar大鼠72只，隨機(jī)分4組:對(duì)照組(control group)、野百合堿組(M group)、50mg·kg-1對(duì)氯苯丙氨酸低劑量預(yù)處理組(M+P1 group)和100m

9、g·kg-1對(duì)氯苯丙氨酸高劑量預(yù)處理組(M+P2 group)。野百合堿組、對(duì)氯苯丙氨酸低劑量組和對(duì)氯苯丙氨酸高劑量組大鼠一次性腹腔內(nèi)注射野百合堿60mg·kg-1;注射后，M+P1組和M+P2組大鼠每天分別腹腔內(nèi)注射對(duì)氯苯丙氨酸50mg·kg-1和100mg·kg-1，C組和M組大鼠每天腹腔內(nèi)注射等比例體積的生理鹽水，給藥三周。
　　 二、大鼠肺血流動(dòng)力學(xué)和右心室肥厚指數(shù)檢測(cè)
　　 三周以后，用3％戊巴比妥鈉(40mg

10、·kg-1)腹腔注射麻醉大鼠，剝離左頸動(dòng)脈，將充滿肝素的PV-I聚乙烯導(dǎo)管連接壓力換能器，測(cè)體循環(huán)壓。同法將導(dǎo)管插入右頸靜脈，經(jīng)右頸靜脈插入右心室，使其插入肺動(dòng)脈，測(cè)量肺動(dòng)脈壓（多導(dǎo)生理記錄儀，日本光電）。
　　 將大鼠處死取出心臟，仔細(xì)分離右心室（right ventricle，RV）和左心室加室間隔(left ventricle and septum，LV+S)，濾紙吸水后，分別稱量RV和LV+S的重量。以右心指數(shù)(righ

11、t ventricular index，RVI)作為右心肥厚的評(píng)價(jià)指標(biāo)，公式如下:RVI-RV/LV+S×100％
　　 三、肺HE染色和組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)
　　 大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)后，用無菌鹽水驅(qū)血、4％多聚甲醛固定。取大鼠肺下葉固定、石蠟包埋后切成5μm厚的切片，HE染色。在光學(xué)顯微鏡下對(duì)肺血管中膜厚度和肺血管壁面積進(jìn)行測(cè)量分析。分別選擇各組直徑50～100μm的肺小動(dòng)脈，測(cè)量血管外徑、內(nèi)徑，用肺血管中膜厚度百分比評(píng)

12、價(jià)血管的重構(gòu)，公式如下:(Media wall thicknes(％)=external diameter-internal diameter/external diameter×100Wall area(％)=total vessel area-lumen area/total vessel area×100％)
　　 四、檢測(cè)肺組織、肺動(dòng)脈膠原蛋白和彈性蛋白的表達(dá)
　　 石蠟包埋的肺組織切成5μm厚的切片，維多利亞藍(lán)

13、染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察肺血管膠原蛋白和彈性蛋白的表達(dá)。
　　 五、應(yīng)用免疫組化檢測(cè)肺動(dòng)脈CTGF蛋白的表達(dá)
　　 石蠟包埋的肺組織切成5μm厚的切片，參照SP法和DAB試劑盒使用說明書操作，不同的抗體抗原修復(fù)時(shí)間、抗體濃度選擇不同。
　　 六、應(yīng)用Western Blot方法檢測(cè)肺組織中CTGF、MMP-13的蛋白表達(dá)以及ERK、IKK蛋白及其磷酸化形式蛋白的表達(dá)
　　 各組大鼠肺組織勻漿后，15000

14、g、4℃離心30分鐘，提取總蛋白，儲(chǔ)存于-80℃;SDS-PAGE電泳:確定凝膠的體積和濃度，根據(jù)蛋白分子量配不同濃度的分離膠;轉(zhuǎn)膜及封閉:用半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀，根據(jù)分子量決定轉(zhuǎn)膜時(shí)間;將PVDF膜放入封閉液中，4℃孵育過夜;抗體孵育;ECL顯色;半定量分析。
　　 采用統(tǒng)計(jì)分析的方法，分別比較以上不同組別之間各項(xiàng)指標(biāo)的差異，探討對(duì)氯苯丙氨酸對(duì)抗野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓機(jī)制。
　　 七、應(yīng)用Western Blot方法檢測(cè)

15、肺組織中細(xì)胞核和細(xì)胞漿NF-κBp65蛋白含量的變化
　　 參照PP10-細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒使用說明書操作，分別提取漿蛋白和核蛋白，儲(chǔ)存于-80℃;SDS-PAGE電泳:確定凝膠的體積和濃度，根據(jù)蛋白分子量配不同濃度的分離膠;轉(zhuǎn)膜及封閉:用半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀，根據(jù)分子量決定轉(zhuǎn)膜時(shí)間;將PVDF膜放入封閉液中，4℃孵育過夜;抗體孵育;ECL顯色;半定量分析。
　　 采用統(tǒng)計(jì)分析的方法，分別比較以上不同組別之間各項(xiàng)指

16、標(biāo)的差異，探討對(duì)氯苯丙氨酸對(duì)抗野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺內(nèi)ECM重構(gòu)的機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 一、對(duì)氯苯丙氨酸抑制野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈壓和右心室肥厚
　　 成功建立慢性炎性肺動(dòng)脈高壓大鼠模型。與對(duì)照組比較，野百合堿組大鼠平均肺動(dòng)脈壓力顯著升高，對(duì)氯苯丙氨酸高劑量組可顯著降低野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈壓力。與對(duì)照組相比，野百合堿組大鼠右心肥厚指數(shù)明顯增加，而對(duì)氯苯丙氨酸劑量依賴性地抑制了野百合堿誘導(dǎo)的右心

17、室肥厚。
　　 二、對(duì)氯苯丙氨酸劑量依賴性地抑制肺小動(dòng)脈重構(gòu)
　　 野百合堿組肺小動(dòng)脈血管壁厚度比對(duì)照組明顯增厚。對(duì)氯苯丙氨酸劑量依賴性地抑制了肺小動(dòng)脈血管壁增厚。野百合堿組肺小動(dòng)脈血管壁面積與對(duì)照組相比明顯增加。對(duì)氯苯丙氨酸劑量依賴性地減少肺小動(dòng)脈血管壁面積。這表明對(duì)氯苯丙氨酸劑量依賴性地抑制野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺小動(dòng)脈重構(gòu)。
　　 三、檢測(cè)肺組織和肺動(dòng)脈中膠原蛋白和彈性蛋白的表達(dá)
　　 應(yīng)用維多利亞藍(lán)染

18、色法染色結(jié)果表明:在肺組織中，與對(duì)照組相比，MCT組血管壁彈性纖維和膠原纖維明顯增多，且肺組織間隙也存在大量的彌散性膠原蛋白。MCT+P2組血管彈性纖維和膠原纖維明顯減少。肺動(dòng)脈中，與對(duì)照組相比，MCT組和MCT+P1組血管壁周圍彈性蛋白變化不明顯，但MCT組肺動(dòng)脈間大量彌漫性膠原蛋白。MCT+P2組血管壁周圍膠原蛋白明顯減少。
　　 四、對(duì)氯苯丙氨酸抑制肺組織CTGF和MMP-13蛋白表達(dá)
　　 野百合堿組肺組織中的C

19、TGF和MMP-13表達(dá)顯著增加，對(duì)氯苯丙氨酸劑量依賴性地降低了野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺組織CTGF和MMP-13的過度表達(dá)。
　　 五、對(duì)氯苯丙氨酸抑制肺組織ERK和IKK磷酸化蛋白含量的表達(dá)
　　 野百合堿組肺組織中的ERK和IKK蛋白表達(dá)沒有顯著變化，但ERK和IKK磷酸化形式蛋白的表達(dá)明顯增加，對(duì)氯苯丙氨酸劑量依賴性地降低了野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺組織中ERK和IKK磷酸化蛋白的過度表達(dá)。
　　 六、免疫組織化學(xué)

20、SP法檢測(cè)肺動(dòng)脈CTGF的表達(dá)
　　 免疫組織化學(xué)研究結(jié)果表明，與Control組相比MCT組大鼠肺動(dòng)脈CTGF表達(dá)水平增高，對(duì)氯苯丙氨酸劑量依賴性地降低了野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈CTGF的陽(yáng)性表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1.MCT誘導(dǎo)的PAH肺內(nèi)ECM重構(gòu)與CTGF激活I(lǐng)KK-NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。
　　 2.PCPA抑制野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺內(nèi)ECM重構(gòu)與抑制CTGF有關(guān)。
　　 3.PCPA