棉花農(nóng)桿菌花粉管通道遺傳轉(zhuǎn)化方法的建立與轉(zhuǎn)基因高油棉花種質(zhì)的創(chuàng)造及其應(yīng)用.pdf

1、棉花是重要的經(jīng)濟作物，它給人類提供了豐富的紡織原料。棉花種子中含有大量的脂肪和蛋白質(zhì)成分，也是重要的油料作物之一。棉花遺傳育種目標主要集中于提高棉花纖維的產(chǎn)量和品質(zhì)，而對提高棉花主要副產(chǎn)品棉籽的含油量研究報道很少。開展高含油量棉花的育種，對減緩世界能源緊張和提高國民經(jīng)濟生產(chǎn)有重要意義。
　　本研究中，選用了克隆自斑鳩菊的二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的其中一個基因VgDGAT1a，研究其對提高棉籽含油量的作用。同時，為提高田間篩選和收獲的效率

2、，選用了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗草甘膦基因EPSPS-G6作為篩選基因，通過優(yōu)化田間轉(zhuǎn)化體系，創(chuàng)制同時含有高油基因和抗草甘膦基因的棉花新種系。主要研究結(jié)果如下:
　　1.以pCAMBIA1301為植物表達載體，構(gòu)建了含高油基因VgDGAT1a的兩個載體，pCAMBIA1301-VgDGAT1a和pCAMBIA1301-VgDGAT1a+EPSPS-G6，篩選基因分別為潮霉素抗性基因hyg和草甘膦抗性基因EPSPS-G6。
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3、.創(chuàng)制了農(nóng)桿菌-花粉通道遺傳轉(zhuǎn)化方法，顯著提高了遺傳轉(zhuǎn)化效率。以中棉所49號為受體材料，借助棉花授粉時產(chǎn)生的花粉管通道，用農(nóng)桿菌侵染自花授粉的棉花柱頭能夠有效獲得轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化效率可達18％，為棉花基因工程和基因功能驗證提供了一個優(yōu)良的遺傳轉(zhuǎn)化方法和平臺。該技術(shù)選擇次日開放的棉花花蕾，用燕尾夾夾住花蕾自交;開花當天用農(nóng)桿菌進行柱頭侵染處理，并保持自交狀態(tài);收獲的種子種于大棚內(nèi)，真葉展開后根據(jù)外源基因的篩選標記進行田間篩選，獲得轉(zhuǎn)基因候

4、選植株用PCR和Southern blot檢測驗證。農(nóng)桿侵染處理時間以下午較好;草甘膦篩選濃度以20 mL/L較有效。
　　3.創(chuàng)制了抗草甘膦、高油的轉(zhuǎn)基因種質(zhì)系。通過本研究創(chuàng)制的遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得的轉(zhuǎn)基因候選植株，經(jīng)PCR檢測，大多能夠擴增出VgDGAT1a和EPSPS-G6基因條帶。Southern blot結(jié)果表明，不同轉(zhuǎn)基因植株間的外源基因的拷貝數(shù)為1～5個，說明這兩個外源基因已經(jīng)整合到棉花的基因組中。轉(zhuǎn)基因植株均能開花結(jié)實