壬基酚干擾17β-雌二醇對(duì)豚鼠缺血再灌注損傷心肌保護(hù)作用的研究.pdf

1、目的：
　　 環(huán)境激素又稱環(huán)境內(nèi)分泌干擾物（endocrine disrupting chemicals，EDCs），是指一類能使內(nèi)分泌功能發(fā)生變化，并因此而對(duì)個(gè)體及其子孫產(chǎn)生有害的外源性化學(xué)物質(zhì)或混合物。壬基酚(nonylphenol，NP)又稱為壬基苯酚，屬于烷基酚類環(huán)境激素。環(huán)境中的NP主要來(lái)源于壬基酚聚氧乙烯醚的降解，壬基酚聚氧乙烯醚因具有強(qiáng)大的脂溶性能夠滲入各種物質(zhì)中，所以被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、洗滌劑、塑料、紡織品、化妝品

2、等商品中，因此NP污染范圍較為廣泛。
　　 NP能在生物體中積蓄進(jìn)而發(fā)揮其毒性作用，有研究表明，NP能干擾生殖器的早期發(fā)育，降低雌性動(dòng)物的生育指數(shù)和雄性動(dòng)物的精子存活率;通過(guò)消化道積蓄于肝臟和腦后，能夠破壞肝臟中超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶等抗氧化物質(zhì)，損傷神經(jīng)細(xì)胞，甚至能夠通過(guò)胎盤影響仔鼠的學(xué)習(xí)記憶能力;有研究報(bào)道壬基酚乙氧基化物對(duì)兩棲動(dòng)物心室細(xì)胞心肌膜的超微結(jié)構(gòu)具有損傷作用。
　　 心肌缺血再灌注損傷（myocardi

3、al ischemia reperfusion injury，MIRI）是冠心病治療后容易產(chǎn)生的一種較為嚴(yán)重的心肌損傷，目前認(rèn)為MIRI主要與鈣超載、自由基爆發(fā)、能量代謝、細(xì)胞因子和炎癥反應(yīng)等相關(guān)。流行病學(xué)研究表明，人類對(duì)缺血性心臟病的易感與環(huán)境激素的污染密切相關(guān)，但是NP等環(huán)境內(nèi)分泌干擾物是否加重豚鼠離體心臟缺血再灌注損傷目前尚無(wú)研究報(bào)道。
　　 17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）是天然雌激素中活性最強(qiáng)的一種，

4、能夠恢復(fù)缺血再灌注損傷后的心功能，緩解心肌損傷。NP具有雌激素樣作用，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與E2相似，可競(jìng)爭(zhēng)性抑制E2與靶器官雌激素受體（Estrogen receptor，ER）結(jié)合。NP與ER結(jié)合后，通過(guò)環(huán)磷酸腺苷依賴的信號(hào)傳導(dǎo)通路，作用于受體，啟動(dòng)一系列雌激素依賴性生理生化過(guò)程;亦可通過(guò)在不同的靶器官組織中改變雌激素細(xì)胞核激素受體的活性，干擾內(nèi)生的雌激素作用，包括增強(qiáng)或抑制內(nèi)源性雌激素的活性。有研究報(bào)道，NP與E2聯(lián)合使用后能夠增強(qiáng)E2的雌

5、激素作用，但是否能夠干擾E2對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，目前尚無(wú)研究報(bào)道。
　　 Langendorff灌流裝置是研究離體心臟缺血再灌注常用的方法，該法通過(guò)配制與血液成分相似的灌流液進(jìn)行主動(dòng)脈逆行灌流離體心臟的冠狀動(dòng)脈模擬心臟在體功能。因能夠排除心臟在體條件下神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用而被廣泛應(yīng)用于藥物對(duì)心臟作用等研究中。然而利用Langendoff灌流研究缺血再灌注損傷的方法中仍存在一些問(wèn)題:如缺血再灌注損傷模型中缺血時(shí)間的選取、心臟

6、缺血再灌注后進(jìn)行TTC染色最適宜的觀察時(shí)間和Langendorff灌流系統(tǒng)的穩(wěn)定性等。
　　 因此基于以上疑問(wèn)，本研究首先通過(guò)制備豚鼠離體心臟缺血再灌注模型，明確該模型中TTC染色法的適宜觀察時(shí)間及計(jì)算方法，并確定適宜的缺血時(shí)間。其次，通過(guò)觀察離體豚鼠心功能等指標(biāo)確定NP直接灌流心臟是否能對(duì)心臟產(chǎn)生毒性作用和NP作用于缺血再灌注期間能否加重離體心臟缺血再灌注損傷，并進(jìn)一步探索NP是否能夠干擾E2對(duì)豚鼠離體心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)

7、作用。
　　 方法：
　　 豚鼠離體心臟進(jìn)行Langendorff灌流，①分為Control和I30R60組，將心臟橫切為5片，棄去心耳片后，由心耳往心尖方向依次記為第1片、第2片、第3片、第4片并進(jìn)行TTC染色，分別于染色后4個(gè)時(shí)間點(diǎn)（1、2、3、4周）對(duì)4個(gè)橫切片進(jìn)行逐個(gè)觀察，并通過(guò)統(tǒng)計(jì)前2片、前3片和前4片的方法計(jì)算梗死面積百分比;②分為Control、I30R60組、I40R60組、I50R60組，觀察不同缺血組

8、缺血前及再灌注期間心率(heart rate，HR)和冠脈流量（coronary flow，CF），測(cè)定灌流液中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)漏出量和組織中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondial-dehyde，MDA)含量，并以TTC法測(cè)定梗死面積;③分為Control、10-7M NP組、10-5

9、 M NP組，觀察2個(gè)濃度NP灌流心臟后HR、CF和灌流液中LDH漏出量的變化;④分為I50R60組、10-7 M NP缺血再灌注組、10-5 M NP缺血再灌注組，觀察2個(gè)濃度NP作用后離體心臟在再灌注期間HR、CF、灌流液中LDH、CK漏出量和組織中SOD的變化;⑤分為I50R60組、10-7 M E2組、10-7 M NP+10-7 M E2組、10-5M NP+10-7M E2缺血再灌注組，觀察2個(gè)濃度NP與10-7M E2聯(lián)合

10、使用后對(duì)離體心臟再灌注期間HR、CF、灌流液中LDH、CK漏出量和組織中SOD的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、與Control組相比，I30R60組心臟在1周內(nèi)觀察時(shí)第1至第4橫切片梗死面積百分比均顯著增加;2周內(nèi)觀察時(shí)，第2、3、4橫切片可見(jiàn)明顯梗死區(qū)域;3周內(nèi)觀察時(shí)，4個(gè)心臟橫切片無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;4周內(nèi)觀察時(shí)，僅第4片具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在計(jì)算梗死面積百分比方法中，與Control組相比，I30R60組心臟無(wú)論采用前2片

11、、前3片和前4片進(jìn)行計(jì)算，在1周和2周內(nèi)觀察均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而在3、4周內(nèi)觀察均無(wú)明顯差異。
　　 2、與Control組相比，I30R60組各指標(biāo)尚未全部發(fā)生顯著性變化;I40R60和I50R60組HR和CF降低，梗死面積增大，灌流液中LDH和CK漏出值升高，組織中SOD和MDA值降低;上述所觀察指標(biāo)中，I50R60組變化更為顯著。
　　 3、10-7 M NP直接灌注離體心臟能在灌流初期顯著提高HR、而對(duì)CF和LD

12、H無(wú)影響。而10-5M NP能顯著降低HR和CF，并使LDH漏出量顯著升高。
　　 4、10-7M NP和10-5M NP處理I50R60模型結(jié)果顯示，2個(gè)濃度的NP對(duì)再灌注期間HR無(wú)影響，CF基本不變，而10-5M NP的CF改變率也僅在再灌初期有所降低，2個(gè)濃度NP不影響I50R60模型的梗死面積百分比，10-5M NP均能夠顯著降低再灌注第5 min的LDH值，但隨灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，LDH漏出量逐漸上升，而10-5MNP組降

13、低再灌注第40 min和60 min的LDH值。隨著NP濃度的升高，SOD值明顯降低。
　　 5、10-7M E2能夠升高再灌期間的HR，對(duì)CF無(wú)明顯影響，但能夠減少梗死面積，降低再灌注期間的LDH和CK值，且能夠降低心肌組織中的SOD值。2個(gè)濃度NP分別與E2聯(lián)合使用作用于缺血再灌注模型后均能逆轉(zhuǎn)E2對(duì)心臟再灌注HR的提高作用，且能使梗死面積增加。10-7M E2和10-5M NP聯(lián)合組能明顯升高再灌期間的LDH和CK值的漏出

14、量，提示10-5M NP可能干擾10-7M E2對(duì)豚鼠離體心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。
　　 結(jié)論：
　　 1、用TTC染色法評(píng)價(jià)豚鼠離體心臟缺血再灌注損傷時(shí)，可以采用單片或多片心臟橫切片評(píng)估梗死程度，并且需要在染色后2周內(nèi)觀察為宜。
　　 2、豚鼠離體心臟缺血再灌注損傷受缺血時(shí)間的影響，豚鼠離體心臟缺血再灌注損傷模型的建立以缺血50 min為宜，再灌注時(shí)間可考慮限制于15 min至60 min之間。