Sirt1對缺血再灌注損傷心肌的保護(hù)作用及信號通路機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　隨著社會環(huán)境和飲食結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)病率和死亡率在心血管系統(tǒng)疾病中出現(xiàn)逐年上升趨勢，而且發(fā)病年齡越來越年輕，特別是冠心?。–oronary Heart Disease， CHD）、急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction，AMI）和心力衰竭（Cardiac Failure， CHF）等是心血管疾病發(fā)病率和死亡率增加的主要原因，也是心臟源性猝死的主要病因之一[1]。在發(fā)達(dá)國家死亡原因最常見的是

2、冠心病[2]。WHO全球統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示由冠心病和循環(huán)系統(tǒng)疾病導(dǎo)致的死亡從1999年至2010年已經(jīng)上升了1/3，而在2015年每死亡3個人中就有一個是由于冠心病[3]，因此預(yù)防和治療冠心病成為人類迫切解決的問題。
　　Sirt1近似同種類的酵母沉默信息調(diào)節(jié)因子2（Silent Information Regulator-2， Sir2），是依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide，

3、NAD）脫乙酰蛋白酶。Sirtuins有7個家族成員即Sirt1~Sirt7，但是Sirt1一直是被廣泛研究的sirtuin蛋白[4]。Sirt1在大腦、心臟、肝臟、胰腺、骨骼肌、脾臟和脂肪組織等身體器官中表達(dá)，它存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中但主要是在細(xì)胞核中表達(dá)[2]。Sirt1調(diào)節(jié)的脫乙酰化作用對于許多蛋白質(zhì)的活性具有重要的作用，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯，蛋白質(zhì)的翻譯在許多生物功能中具有重要的功能，如氧化應(yīng)激、新陳代謝、細(xì)胞增殖和基因組的穩(wěn)

4、定性[5]。此外，Sirt1一直與老化、代謝疾病、神經(jīng)退化性疾病、癌癥和心血管疾病有關(guān)[6]。
　　磷脂酰肌醇-蘇氨酸蛋白激酶（Phosphatidyl Inositol3-kinase/ Serine-threomine kinase, PI3k-Akt）信號通路不僅在癌癥中具有重要的作用，而且在正常細(xì)胞中也具有重要的作用。這條通路在細(xì)胞的許多生物學(xué)功能中具有重要的作用，如增殖、粘附、遷移、侵入、代謝和存活等[7]?；谏鲜銮闆r

5、，根據(jù)目前國內(nèi)外有關(guān)的研究進(jìn)展我們提出以下問題：白藜蘆醇能否促進(jìn)Sirt1的表達(dá)，并在缺血灌注損傷中保護(hù)心肌細(xì)胞？Sirt1是否通過上調(diào)PI3k-Akt信號通路起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用呢？
　　研究目標(biāo)：
　　1．觀測在缺血再灌注損傷過程中Sirt1是否對心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。
　　2．探討Sirt1對PI3k-Akt信號通路的影響，明確Sirt1心臟保護(hù)作用的發(fā)生機(jī)制。
　　研究方法：
　　1．心肌細(xì)胞系（

6、H9c2）隨機(jī)分為對照組（ Control組）和缺氧復(fù)氧組（ H/R），其中缺氧復(fù)氧組分為3組，一組給予含25μM白藜蘆醇培養(yǎng)基培養(yǎng)，一組給予含1μM EX527和25μM白藜蘆醇培養(yǎng)基，最后一組給予正常培養(yǎng)基，培養(yǎng)2 d-3 d后進(jìn)行缺氧復(fù)氧干預(yù)，對照組不做任何處理。
　　2．應(yīng)用 TUNEL免疫熒光染色法，在熒光顯微鏡下觀察各組 H9c2心肌細(xì)胞系細(xì)胞凋亡情況并計算凋亡率。
　　3．應(yīng)用DHE免疫熒光染色法在熒光顯微鏡下

7、觀察各組心肌細(xì)胞的活性氧水平，并計算活性氧比率。
　　4．應(yīng)用MTT比色法，檢測各組心肌細(xì)胞的細(xì)胞活性。
　　5．采用 JC-1免疫熒光染色法，檢測各組心肌細(xì)胞中線粒體的膜電位，并計算紅光與綠光的比值。
　　6．應(yīng)用抗體免疫熒光檢測Sirt1在心肌細(xì)胞核中的表達(dá)情況。
　　7．采用Western Blotting免疫印跡法檢測各組心肌細(xì)胞中Sirt1和p-Akt表達(dá)情況。
　　8．采用Western Blo

8、tting免疫印跡法檢測加入Akt特異性抑制劑LY294002后，心肌細(xì)胞中Sirt1和p-Akt蛋白的表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果：
　　1．與對照組（0.240±0.007）相比，缺氧復(fù)氧組（0.487±0.013）凋亡率顯著上升（ P<0.001）；與缺氧復(fù)氧組（0.487±0.013）相比，加入Sirt1激動劑白藜蘆醇預(yù)處理組（0.255±0.010）凋亡率顯著降低（ P<0.001），而Sirt1抑制劑組（0.569±

9、0.010）凋亡率最高（ P<0.001）。
　　2．與對照組（0.222±0.004）相比，缺氧復(fù)氧組（0.372±0.020）細(xì)胞活性氧水平顯著上升（ P<0.001），與缺氧復(fù)氧組（0.372±0.020）相比，白藜蘆醇預(yù)處理組（0.256±0.026）活性氧水平顯著降低（ P<0.001），而EX527組（0.593±0.018）細(xì)胞活性氧顯著上升（ P<0.001）。
　　3．與對照組（0.778±0.007）相比

10、，缺氧復(fù)氧組（0.455±0.002）細(xì)胞活性顯著降低（ P<0.001）缺氧復(fù)氧組（0.455±0.002）相比，白藜蘆醇組（0.587±0.005）細(xì)胞活性水平顯著上升（ P<0.001），EX527組（0.240±0.009）細(xì)胞活性水平最低（ P<0.001）。
　　4．與對照組（3.822±0.007）相比，缺氧復(fù)氧組（2.579±0.006）線粒體膜電位水平顯著降低（ P<0.001），與缺氧復(fù)氧組（2.579±0.0

11、06）相比，白藜蘆醇組（3.904±0.042）線粒體膜電位顯著上升（ P<0.001），而EX527組（1.517±0.037）線粒體膜單位水平最低（ P<0.001）。
　　5．與對照組（0.333±0.026）相比，白藜蘆醇組（0.574±0.018）中Sirt1在細(xì)胞核的表達(dá)也顯著增加（ P<0.001）。
　　6．對照組中Sirt和p-Akt相對灰度值分別為（1.697±0.020）和（0.0137±0.0005）

12、；缺氧復(fù)氧組分別為（2.141±0.015）和（0.0156±0.0004）；與對照組相比，缺氧復(fù)氧組中Sirt1的表達(dá)水平顯著降低（ P<0.001），而p-Akt蛋白的表達(dá)無顯著性差異。白藜蘆醇組相對灰度值為（3.434±0.010）和（0.0227±0.0009），與缺氧復(fù)氧組（2.141±0.015）和（0.0156±0.0004）相比，Sirt1和p-Akt蛋白表達(dá)顯著上升（ P<0.001）；EX527組蛋白灰度值為（1.5

13、30±0.030）和（0.0120±0.0004），與缺氧復(fù)氧組相比Sirt1和p-Akt蛋白的表達(dá)水平顯著降低（ P<0.001）。
　　7． LY294002可以抑制Akt蛋白的表達(dá)水平，對照組中p-Akt蛋白的相對灰度值為（2.353±0.059），加入LY294002后p-Akt蛋白的相對灰度值為（1.548±0.021），兩組相比具有顯著的差異（ P<0.001）。加入LY294002后Sirt1蛋白的表達(dá)也顯著降低，對

14、照組中Sirt1蛋白的相對灰度值為（2.355±0.262），而加入LY294002后Sirt1蛋白的相對灰度值為（1.214±0.151），兩組相比具有高度顯著差異（ P<0.001）。
　　研究結(jié)論：
　　1．缺氧復(fù)氧能成功模擬心肌梗死缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞系 H9c2細(xì)胞凋亡率顯著上升。
　　2． Sirt1能夠減輕H9c2細(xì)胞在缺血再灌注中的損傷，其中PI3k-Akt信號通路在Sirt1減輕H9c2缺血再灌注損