基于“腦腸菌軸”探討痛瀉要方治療IBS模型大鼠新機制.pdf

1、目的：
　　腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)作為典型而常見的情志病，腦腸互動異常已獲得中西醫(yī)學(xué)界共識，但是，腸道菌群在IBS發(fā)生發(fā)展與中藥療效進程中的具體作用機制，仍缺乏研究。本文基于“腦腸菌軸”（Brain-gut–enteric microbiota axis,BGMA）更高更完整之研究視野，一方面更系統(tǒng)深入地揭示IBS病理生物學(xué)基礎(chǔ)，另一方面以痛瀉要方為代表方觀察其調(diào)控BGMA關(guān)鍵環(huán)節(jié)

2、和調(diào)節(jié)模式，探討中醫(yī)藥防治IBS新機制。
　　方法：
　　選用8周齡SPF級Sprague-Dawley大鼠100只，雌雄各半，給予慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激聯(lián)合高糖高脂飼料、高溫高濕環(huán)境加酒精刺激建立慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激脾胃濕熱泄瀉型IBS模型，通過大鼠體重增長率、糞便Bristoi評分、AWR評分及敞箱實驗評分，綜合評價與鑒定IBS大鼠模型。將造模成功大鼠隨機分為模型對照組（M）、痛瀉要方7天治療組（T7）、痛瀉要方14天

3、治療組（T14）、雙歧桿菌7天治療組（B7）、雙歧桿菌14天治療組（B14），加正常對照組共6組。經(jīng)受試藥痛瀉要方及陽性對照藥物雙歧桿菌灌胃7天、14天，實時觀察大鼠一般情況、體重增長率、Bristol糞便性狀評分、腹壁回撤反射（AWR）評分及敞箱實驗評分等指標(biāo)，驗證痛瀉要方對IBS模型治療的有效性。在不同組別特定時間窗口，無菌法采集糞便，經(jīng)心臟灌洗后取腦組織、結(jié)腸組織標(biāo)本。采用免疫組化法檢測大鼠海馬區(qū)、結(jié)腸組織一氧化氮合酶（NOS）、

4、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（CHAT）、血管活性腸肽（VIP）、Fos蛋白表達情況，探索痛瀉要方對IBS模型“腦腸軸”紊亂的調(diào)節(jié)機制。提取腸道菌群總RNA、反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實時定量PCR檢測腸道菌群色氨酸合成酶基因的表達，探討痛瀉要方對腸道菌群關(guān)鍵性活性物質(zhì)的影響。提取腸道菌群總DNA，應(yīng)用Illumina高通量測序平臺進行宏基因組測序，通過Blast等比對軟件對基因進行NR物種分類、COG、KEGG功能注釋，探討痛瀉要方對腸道菌群種類及蛋白

5、、代謝通路功能的影響。
　　結(jié)果：
　　1、對IBS模型的評價：與N組比較，IBS模型大鼠精神萎靡、易激惹，弓背，倦怠蜷臥，反應(yīng)遲鈍，活動減少，測定敞箱實驗評分明顯減少（P<0.05）；食欲減低，檢測體重增長率明顯降低（P<0.05）；出現(xiàn)不同程度稀便，毛發(fā)發(fā)黃、污穢、缺少光澤，肛周夾有粘液或體毛被稀便沾染，檢測Bristol糞便性狀評分、AWR評分均明顯增加（P<0.05）。
　　2、痛瀉要方對IBS模型大鼠療效評價

6、：與M組比較，T14、B14組可明顯改善IBS模型大鼠精神狀態(tài)、飲食、毛發(fā)等一般情況，體重增長率、敞箱實驗評分均明顯增加（P<0.05），而Bristol糞便性狀評分，AWR均明顯降低（P<0.05）；T7、B7組以上指標(biāo)變化無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。
　　3、痛瀉要方對IBS模型大鼠海馬區(qū)、結(jié)腸組織CHAT、NOS、VIP、Fos的影響：與N組比較，M組大鼠海馬區(qū)、結(jié)腸組織CHAT、c-Fos、VIP表達明顯增加（P<0.0

7、5），NOS表達明顯降低（P<0.05）；與M組比較，T14、B14組IBS模型大鼠海馬區(qū)、結(jié)腸組織CHAT、c-Fos、VIP表達明顯減少（P<0.05），NOS表達明顯增加（P<0.05），T7、B7組以上指標(biāo)變化無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。
　　4、痛瀉要方對IBS模型大鼠腸道菌群TRPA基因表達的影響：與N組比較，M組大鼠腸道菌群TRPA基因表達水平明顯降低（P<0.05）；與M組比較，T14、B14組TRPA基因的表達

8、明顯升高（P<0.05），T7、B7組TRPA基因表達變化無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。
　　5、痛瀉要方對IBS模型大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響：與N組比較，M組大鼠腸道類桿菌門（Bacteroidia）豐度降低、梭狀芽孢桿菌門（Clostridia）豐度升高；與M組比較，T7、T14組和B7、B14組類桿菌門（Bacteroidia）豐度均有升高趨勢，梭狀芽孢桿菌門（Clostridia）豐度均有降低趨勢。屬水平heatmap顯示腸

9、道菌群結(jié)構(gòu)和豐度比較，T7組與B7組有相似性、T14組與B14組有相似性，四個治療組與N組之間有一定相似性，M組與其他組差異最大。
　　6、痛瀉要方對IBS模型大鼠腸道菌群COG聚類的影響：與N組比較，M組大鼠腸道菌群在能量的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化、氨基酸的轉(zhuǎn)運和代謝、碳水化合物的轉(zhuǎn)運和代謝、酶的轉(zhuǎn)運和代謝、脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運和代謝功能COG蛋白功能聚類降低；與M組比較，T7、T14組和B7、B14組以上功能蛋白COG聚類有升高趨勢。COG聚類hea

10、tmap比較，T7組與B7組有相似性、T14組與B14組有相似性，四個治療組與N組之間有一定相似性，M組與其他組差異最大。
　　7、痛瀉要方對IBS模型大鼠腸道菌群KEGG代謝通路聚類的影響：與N組比較，M組大鼠腸道菌群在ko00970氨酰生物合成、ko00230嘌呤代謝，ko00240嘧啶代謝、ko00640丙酸代謝、ko00030糖磷酸通路、ko00400苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸代謝、ko03020RNA多聚酶代謝的KEGG聚

11、類降低。與M組比較，T7、T14組和B7、B14組以上KEGG聚類有升高趨勢。COG聚類heatmap比較，T7組與B7組有相似性，再與M組有一定相似性；T14組與B14組有相似性，再與N組有一定相似性。
　　結(jié)論：
　　1、IBS的發(fā)病與腦腸軸相關(guān)腦腸肽調(diào)節(jié)紊亂有關(guān)，同時，腸道菌群結(jié)構(gòu)、蛋白功能及代謝通路改變也是重要發(fā)病機制之一，“腦-腸-菌”軸異常是IBS發(fā)病的重要病理基礎(chǔ)。
　　2、痛瀉要方對IBS模型大鼠治療效