用Real Time PCR和DGGE技術(shù)研究放牧藏系綿羊瘤胃微生物季節(jié)動(dòng)態(tài).pdf

1、藏系綿羊主要分布于西藏、青海、甘肅和四川等高寒地區(qū)，是具有特殊遺傳特性的動(dòng)物，是當(dāng)?shù)啬撩裆畹奈镔|(zhì)基礎(chǔ)和經(jīng)濟(jì)來源。與其它反芻動(dòng)物一樣，藏羊在進(jìn)化過程中獲得的前胃發(fā)酵功能也非常完善和高效。與其它反芻動(dòng)物不同的是，藏羊所生存環(huán)境的更加惡劣，飼料來源更加困難，飼料的營(yíng)養(yǎng)成分也更加貧乏，但環(huán)境脅迫使其對(duì)飼料的利用更為高效，瘤胃的發(fā)酵功能更為完善，為它的生存提供了重要保障。研究瘤胃微生物的目的，是為了了解它們的形態(tài)、生理、繁殖、地理分布、種群相互

2、作用及與宿主之間的相互依賴關(guān)系，為合理利用飼草、飼料資源提供依據(jù)。本論文對(duì)不同季節(jié)青藏高原放牧藏系綿羊瘤胃細(xì)菌、真菌、甲烷菌和琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)的數(shù)量動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了研究，并分別對(duì)不同季節(jié)藏系綿羊瘤胃細(xì)菌和古細(xì)菌區(qū)系的動(dòng)態(tài)進(jìn)行了研究。共進(jìn)行了以下四個(gè)試驗(yàn)： 試驗(yàn)一：采用模擬采食，結(jié)合尼龍袋法的方法，測(cè)定了試驗(yàn)羊放牧地(青海三角城種羊場(chǎng))冬春季、夏季和秋季各牧場(chǎng)的牧草營(yíng)養(yǎng)成分、放牧采食量

3、和消失率。結(jié)果表明：牧草營(yíng)養(yǎng)成分(混合草樣)隨季節(jié)變化，其中粗蛋白質(zhì)、能量含量均為夏季＞秋季＞冬春季；中性洗滌纖維，酸性洗滌纖維含量為夏季＜秋季＜冬春季。春、夏、秋和冬季牧草干物質(zhì)的消失率分別為：48.81±8.25﹪、52.07±1.03﹪、51.43±3.05﹪、50.28±1.23﹪。春、夏、秋和冬季綿羊CP、ME食入量為：2.63±0.01g/kgw0.75·d、0.41±0.00MJ/kgW0.75·d,12.80±0.08g

4、/kgW0.75·d、1.33±0.01MJ/kgW0.75·d,6.39±0.03g/kgW0.75·d、0.57±0.002MJ/kgW0.75·d,4.05±0.01g/kgW0.75·d、0.39±0.003MJ/kgW0.75·d。 試驗(yàn)二：以青藏高原環(huán)青海湖地區(qū)藏系綿羊瘤胃內(nèi)容物為樣品，以獲取盡可能全面代表瘤胄微生物種類、不被其它來源DNA污染的可用于分子生物學(xué)研究的總DNA為目的，采用改進(jìn)后的液氮反復(fù)凍融+CTAB

5、法提取微生物總DNA。提取瘤胃微生物總DNA長(zhǎng)度在23Kb以上，OD260/OD280均在1.59-1.68。用細(xì)菌和古細(xì)菌的16SrDNA通用引物和特異引物，從純化前后瘤胃微生物總DNA中成功擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，表明該法能充分破碎包括細(xì)菌、真菌在內(nèi)的各種瘤胃微生物細(xì)胞壁。 試驗(yàn)三：以青藏高原環(huán)青海湖地區(qū)藏系綿羊瘤胃內(nèi)容物樣品總DNA，研究不同季節(jié)藏系綿羊瘤胃微生物的季節(jié)變化。采用RealTimePCR技術(shù)，利用國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)提供的

6、細(xì)菌、真菌、產(chǎn)甲烷菌和琥珀酸絲狀桿菌的引物，在建立了瘤胃微生物絕對(duì)定量與相對(duì)定量的分子生物學(xué)方法基礎(chǔ)上，研究不同季節(jié)藏系綿羊瘤胃細(xì)菌、真菌、產(chǎn)甲烷菌、琥珀酸絲狀桿菌的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明：①夏季由于動(dòng)物采食大量營(yíng)養(yǎng)豐富的牧草，因而其瘤胃內(nèi)細(xì)菌數(shù)量明顯高于其它三個(gè)季節(jié)，分別是春季、冬季和秋季的5.56，2.35、2.49倍；秋季和冬季瘤胃細(xì)菌數(shù)量變化卻不明顯。②夏季瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌數(shù)量明顯高于其它三個(gè)季節(jié)，分別比冬季、秋季和春季增加353.1

7、5﹪、334.69﹪、545.31﹪：秋季和冬季瘤胃產(chǎn)甲烷菌數(shù)量變化卻不明顯(僅比冬季低4﹪)。③瘤胃真菌在秋、冬、春、夏季，真菌在瘤胃內(nèi)相對(duì)約為細(xì)菌的0.14﹪，0.11，0.19﹪和0.03﹪。瘤胃真菌秋季比冬、夏季增加了19.34﹪、79.55﹪，夏、冬季比春季降低了84.92﹪、68.18﹪，夏季比冬季降低了74.65﹪，春季比秋季高出35.66﹪。④春季瘤胄琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量低于其它三季，春季比夏季、秋季和冬季降低了20.58

8、﹪、54.31﹪、58.53﹪。冬季比夏季、秋季增加了50.00﹪、10.19﹪，秋季比夏季增加了44.90﹪。 試驗(yàn)四：以青海放牧藏系綿羯羊瘤胃內(nèi)容物微生物總DNA為模板，用有GC夾的引物經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增細(xì)菌DNA的16SrDNA的V6-V8區(qū)和古細(xì)菌DNA的16SrDNA的V2-V4，擴(kuò)增產(chǎn)物利用變性梯度凝膠電泳技術(shù)(DGGE，一種DNA指紋技術(shù))分析瘤胃細(xì)菌及古細(xì)菌區(qū)系的季節(jié)變化。結(jié)果表明：①瘤胃細(xì)菌區(qū)系在秋

9、、冬季相似性低于60﹪，而在春季和夏季相似性大于90﹪；秋季瘤胃細(xì)菌多樣性指數(shù)值(Shannon-Wiener指數(shù))為1.42±0.07，顯著(p＜0.05)高于其它三季節(jié)，冬、春、夏多樣性指數(shù)值分別為1.27±0.08、1.29±0.03、1.28±0.04，三者之間差異不顯著(p＞0.05)。②秋季、冬季、春季和夏季瘤胃古細(xì)菌區(qū)系相似性高于90﹪：冬、春、夏、秋季節(jié)瘤胃古細(xì)菌多樣性指數(shù)值分別為1.39±0.02、1.33±0.098

10、、1.25±0.05、1.19±0.03；瘤胄古細(xì)菌種多樣性，冬季與春季差異不顯著(p＞0.05)，但顯著高于夏季(p＜0.05)，極顯著高于秋季(p＜0.01)，而春季與夏季差異不顯著(p＞0.05)，顯著高于秋季(p＜0.05)；夏、秋季差異不顯著(p＞0.05)。 本試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同放牧季節(jié)，藏系綿羊采食養(yǎng)分含量不同的牧草，不但影響著瘤胃微生物的數(shù)量，而且也影響著微生物多樣性。夏季微生物數(shù)量高于其它季節(jié)，秋季微生物多樣性