組學技術(shù)研究亞急性瘤胃酸中毒對奶牛瘤胃微生物、代謝和上皮功能的影響.pdf

1、瘤胃是反芻動物營養(yǎng)物質(zhì)消化代謝的主要場所，其健康與否直接關(guān)系動物機體健康與生產(chǎn)性能的發(fā)揮。本論文擬系統(tǒng)研究高精料日糧對奶牛瘤胃健康和泌乳性能的影響，研究內(nèi)容包括以下四方面。
　　1.SARA對瘤胃細菌菌群結(jié)構(gòu)與組成的影響
　　試驗選用4頭裝有瘤胃瘺管的泌乳奶牛，將其隨機分為對照組（CON，40％精料）或SARA組（SARA，70％精料），采用2×2交叉試驗設(shè)計。每試驗期第12、17和21天晨飼后0h采集瘤胃液樣品，提取基因組

2、DNA，進行焦磷酸測序。結(jié)果顯示，SARA組奶牛瘤胃pH低于5.8的持續(xù)時間大于5小時，表明SARA模型成功構(gòu)建。與對照組相比，SARA組奶牛瘤胃乳酸、丙酸、丁酸、戊酸、總VFA和LPS的濃度(P＜0.05)顯著升高，乙丙比（P＜0.05）顯著降低。SARA組奶牛瘤胃菌群豐度指數(shù)（Chao1和Ace）和多樣性指數(shù)(Shannon)顯著低于(P＜0.05)對照組。在門水平上，SARA組瘤胃變形菌門和擬桿菌門的相對豐度顯著降低(P＜0.05

3、)，但厚壁菌門和放線菌門的相對豐度顯著增加（P＜0.05）。屬水平上，與對照組相比，SARA組奶牛瘤胃中普雷沃氏菌屬、密螺旋菌屬、厭氧支原體屬、不動桿菌屬、Papillibacter和unclassified Lentisphaerae，and unclassified bacteria的相對豐度顯著降低(P＜0.05)，而瘤胃球菌屬、奇異菌屬、雙歧桿菌和unclassified Clostridiales的相對豐度顯著升高（P＜0.0

4、5）。SARA組奶牛瘤胃內(nèi)革蘭氏陰性菌的比例顯著下降，且瘤胃LPS濃度與擬桿菌門細菌拷貝數(shù)間存在顯著負相關(guān)(r=-0.446，P=0.029)。結(jié)果說明，高精料日糧誘發(fā)的SARA可導致瘤胃pH下降，VFA累積，LPS濃度升高;瘤胃細菌菌群結(jié)構(gòu)紊亂，瘤胃細菌菌群的多樣性降低。
　　2.SARA對奶牛瘤胃代謝產(chǎn)物的影響
　　瘤胃微生物菌群的改變與瘤胃代謝密切相關(guān)，本章擬通過研究SARA對奶牛代謝產(chǎn)物的影響，進一步解析SARA對瘤

5、胃健康的影響。試驗動物、試驗設(shè)計與試驗日糧同上。選用每試驗期第12、17、21天晨飼前瘤胃液樣品，進行GC-MS代謝組學檢測。試驗結(jié)果表明，瘤胃液樣品中共檢測到233種化合物，主要包括有機酸類、脂肪酸類、糖類、氨基酸類、嘌呤類、胺類、糖醇類等物質(zhì)。統(tǒng)計顯示，較對照組相比，SARA組黃嘌呤、次黃嘌呤、尿嘧啶等細菌降解產(chǎn)物含量顯著提高(P＜0.05);LPS、生物胺、乙醇胺、戊二酸等有毒有害或促炎物質(zhì)的含量顯著提高（P＜0.05）;丙氨酸、

6、亮氨酸、甘氨酸、谷氨酸、亮氨酸等15種氨基酸的含量顯著提高（P＜0.05）。對差異代謝物的通路富集分析結(jié)果顯示，氨?；鵷RNA生物合成，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成三條通路發(fā)生顯著富集(P＜0.05)。結(jié)果說明，高精料日糧誘發(fā)的SARA會導致瘤胃代謝紊亂，瘤胃內(nèi)有毒或促炎物質(zhì)含量升高，氨基酸合成增加，異常代謝產(chǎn)物的增加可能會影響奶牛瘤胃和機體健康。
　　3.SARA對瘤胃上皮基因表達的影響

7、與機制研究
　　本試驗旨在通過基因芯片技術(shù)研究SARA對瘤胃上皮基因表達的影響，并結(jié)合體外細胞培養(yǎng)手段揭示瘤胃上皮炎癥相關(guān)基因?qū)Ω呔先占Z的響應(yīng)模式及其可能機制。體內(nèi)試驗:試驗動物、試驗設(shè)計與試驗日糧同上。于每期第21 d采集對照組和SARA組瘤胃上皮樣品，進行基因芯片分析。結(jié)果顯示，兩組間共有245個基因存在差異。對差異基因進行通路富集分析和功能注釋后，發(fā)現(xiàn)因子受體與其關(guān)聯(lián)通路(cytokine-cytokine recepto

8、r pathway)顯著富集（P＜0.05），通路中IL-1β、IL-2、IL-22、CCL19、CCL8、CX3CR1、CXCL6、INHBE、LEPR、PRL和TNFRSF9的表達量在SARA組奶牛瘤胃上皮中顯著上調(diào)(P＜0.05)，而通路中IL-6和IL15RA的表達量顯著下調(diào)（P＜0.05），結(jié)果表明，瘤胃上皮可能已發(fā)生局部炎癥反應(yīng)。為驗證基因芯片結(jié)果的準確性，使用qRT-PCR對IL-1β、IL-2和IL-6的mRNA表達量進

9、行了測定。相關(guān)性分析顯示，瘤胃上皮炎癥因子與瘤胃環(huán)境因子（pH和LPS）存在關(guān)聯(lián)(P＜0.05)，為進一步驗證這一結(jié)果，進行體外細胞培養(yǎng)試驗。結(jié)果說明，瘤胃上皮細胞IL-1β、IL-2、IL-6和IL-8的mRNA表達量在LPS處理后顯著上調(diào)（P＜0.05），而低pH值處理顯著提高了瘤胃上皮細胞TNF-α的表達量，表明瘤胃環(huán)境因子pH和LPS可能在SARA引發(fā)瘤胃局部炎癥反應(yīng)過程中起著重要作用。
　　4.SARA對奶牛泌乳性能及原

10、奶細菌菌群的影響
　　本章旨在研究SARA對奶牛泌乳性能及乳中細菌菌群結(jié)構(gòu)和組成的影響。試驗動物、試驗設(shè)計與試驗日糧同上。分別于每試驗期第17、18和19天采集奶樣，并于每試驗期第12、17和21天飼喂后0h和4h采集尾靜脈血，對所采集奶樣中的細菌菌群結(jié)構(gòu)和組成以及所采集血樣中的相關(guān)指標進行分析。結(jié)果顯示，對照組和SARA組奶牛的干物質(zhì)采食量(DMI)、產(chǎn)奶量和乳成分無顯著差異(P＞0.05)。較對照組相比，SARA組奶牛尾靜脈血

11、中白細胞、淋巴細胞數(shù)量和白蛋白的含量顯著升高(P＜0.05)，而總蛋白、球蛋白、膽固醇和低密度脂蛋白的含量顯著降低(P＜0.05)。454測序結(jié)果顯示，原奶中的優(yōu)勢菌群為放線菌門、后壁菌門、變形菌門和擬桿菌門。較對照組相比，SARA組奶牛原奶中乳房炎病原菌，包括Stenotrophomonasmaltophilia、Streptococcus parauberis、Brevundimonas diminuta等細菌的相對豐度顯著提高（P

12、＜0.05）;同時，SARA組奶牛原奶中嗜冷細菌，包括Pseudomonas、Brevundimonas、Sphingobacterium、Alcaligenes、腸桿菌屬和乳桿菌屬等的相對豐度也顯著提高（P＜0.05）。然而，兩組奶牛原奶中細菌菌群的豐度和多樣性指數(shù)(Ace，Chao和Shannon)無顯著差異。結(jié)果說明，本試驗中，SARA雖未顯著影響奶牛的泌乳性能，但可能影響奶牛乳腺健康，增加奶?；既榉垦罪L險，并可能降低原奶和乳制品