奶粉中需氧型成芽孢菌的生物多樣性、腐敗性和存活方式研究.pdf

1、產(chǎn)芽孢類菌是奶粉的潛在污染源，影響奶粉的品質(zhì)及安全性。關(guān)于中國市售奶粉中的中溫及嗜熱產(chǎn)芽孢需氧菌的多樣性、在奶粉加工過程中的生存方式及對奶粉品質(zhì)的研究在中國少有報(bào)道。
　　本文探究了中國市售奶粉的微生物菌群結(jié)構(gòu)，最大程度地揭示奶粉中成芽孢類細(xì)菌的多樣性。基于隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)技術(shù)，從25個(gè)代表性的奶粉樣品中分離到738個(gè)菌株，其中，地衣芽孢桿菌占比最高（約占總株數(shù)的43％）且基因型差異性顯著，嗜熱脂肪地芽孢桿菌、好熱

2、黃無氧芽孢桿菌次之。高溫放線糖萊斯菌與普通嗜熱放線菌的最新報(bào)道表明放線菌對于中國乳制品產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生了新的威脅。奶粉中分離和鑒別出的19個(gè)（除去未鑒定出的5組）菌種中，12個(gè)菌種是在奶粉中被首次報(bào)道。
　　為明確特定微生物群落對奶粉品質(zhì)及安全性的影響，研究了分離菌株的耐熱性及產(chǎn)腐敗酶的能力。于100℃至125℃下測定分離菌所產(chǎn)芽孢的耐熱性，以此來評估耐熱芽孢在生產(chǎn)加工過程中的存活能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中的兩株嗜熱菌（高溫烷烴地芽孢桿菌、嗜熱

3、脂肪地芽孢桿菌）及一株中溫菌（短芽孢桿菌）經(jīng)125℃處理30分鐘后仍能存活。此外，大量分離得到的細(xì)菌能產(chǎn)脂肪酶、蛋白酶、磷脂酶及β-半乳糖苷酶。浸麻類芽孢桿菌的蛋白水解活力最高，之后是蠟狀芽孢桿菌、短芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、高溫烷烴地芽孢桿菌與普勒姆枝芽孢桿菌。地衣芽孢桿菌產(chǎn)脂肪酶的能力最高。只有蠟狀芽孢桿菌與類短短芽孢桿菌能夠產(chǎn)磷脂酶。10個(gè)菌株有較強(qiáng)的β-半乳糖苷酶活力，同時(shí)，4個(gè)菌株有溶血活性。即使在同一RAPD組或亞組的地衣芽孢

4、桿菌，它們的表型特征卻有著顯著差異，這也印證了之前地衣芽孢桿菌RAPD差異性的發(fā)現(xiàn)。
　　生物膜是中國市售奶粉中優(yōu)勢菌的重要生存方式。在聚苯乙烯及不銹鋼介質(zhì)表面，分別測定了不同菌的生物膜形成能力。在脫脂牛奶中培養(yǎng)的不銹鋼表面，只有四個(gè)菌種具有明顯的生物膜形成能力，即地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪地芽孢桿菌、高溫烷烴地芽孢桿菌和好熱黃無氧芽孢桿菌。在脫脂牛奶培養(yǎng)基中，這四種細(xì)菌在不銹鋼片表面生物膜中的最大細(xì)胞數(shù)目分別為4.8，5.2，4.5

5、and5.3log CFU/cm2。對于包括地衣芽孢桿菌在內(nèi)的嗜溫菌來說，在TSB培養(yǎng)基中，每平方厘米生物膜細(xì)菌數(shù)更高，然而嗜熱脂肪地芽孢桿菌、高溫烷烴地芽孢桿菌和好熱黃無氧芽孢桿菌的細(xì)胞數(shù)目降低。無論是在TSB還是脫脂牛奶培養(yǎng)基中，聚苯乙烯表面的結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)都不能充分預(yù)測不銹鋼表面的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)目。生物膜的形成也證明了菌株特性差異，在同一RAPD組中，地衣芽孢桿菌的成膜能力印證了之前闡述的基因型與表觀多樣性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)細(xì)菌生物膜的形

6、成是一種重要生存方式的觀點(diǎn)，在奶粉分離菌中，只有最具優(yōu)勢的菌種才能在脫脂牛奶中培養(yǎng)的不銹鋼表面形成良好的生物膜。研究結(jié)果拓展了乳制品分離菌生物膜形成的理論，并且強(qiáng)調(diào)了菌株與附著介質(zhì)的影響。最后研究了中國奶粉中代表性菌株生物膜形成的生物膜分子調(diào)控機(jī)制。通過RNA測序，分別研究地衣芽孢桿菌不同生物膜形成能力菌株的浮游細(xì)胞（對數(shù)生長期菌株）與生物膜狀態(tài)細(xì)胞（培養(yǎng)24小時(shí)）的轉(zhuǎn)錄變化。相較于浮游狀態(tài)，在生物膜狀態(tài)中，強(qiáng)成膜能力與弱成膜能力的地衣

7、芽孢桿菌株分別有28.3％和36.3％的基因表達(dá)上調(diào)。在兩種狀態(tài)下，幾組基因表達(dá)型差異顯著(P＜0.05)。這些基因與趨化性蛋白(CheA，CheB，CheC，CheD，CheV，CheW，CheY，MotA，MotB)有關(guān)，且所有菌株在浮游狀態(tài)下時(shí)，鞭毛的表達(dá)上調(diào)了。依據(jù)京都基因與基因組百科全書(KEGG)，浮游狀態(tài)下代謝途徑的抑制更為顯著（P＜0.05;Q值＜0.05），表明生物膜的形成過程需要消耗較多能量。脂質(zhì)和糖類的代謝對于生物