青春期肥胖小鼠的運(yùn)動(dòng)及飲食干預(yù)研究.pdf

1、背景:肥胖已經(jīng)成為目前全球最嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題之一，生活方式的調(diào)整——運(yùn)動(dòng)和飲食干預(yù)仍然是預(yù)防及管理肥胖的最優(yōu)共識(shí)，尤其對(duì)于處于生長發(fā)育特殊階段的肥胖兒童群體。通過運(yùn)動(dòng)增加能量消耗是公認(rèn)最綠色健康的減肥方法，在快節(jié)奏的當(dāng)今社會(huì)，研究既有效又高效的運(yùn)動(dòng)處方，對(duì)肥胖及其相關(guān)并發(fā)癥的預(yù)防和治療以及大眾保健都具有重要意義。針對(duì)肥胖的運(yùn)動(dòng)干預(yù)中，高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)(high intensity interval training，HIIT)和中等強(qiáng)度

2、持續(xù)運(yùn)動(dòng)(moderate intensity continuous training，MICT)的爭議一直存在，越來越多研究顯示HIIT在減重及改善心肺適能、糖脂代謝等方面效果優(yōu)于MICT，也有研究認(rèn)為二者效果相似，甚至認(rèn)為HIIT耐受性差或不安全。目前關(guān)于HIIT的作用機(jī)制多關(guān)注于心血管代謝及骨骼肌能量代謝，對(duì)肥胖及其并發(fā)癥的全身及組織能量代謝干預(yù)效果及其機(jī)制研究還很少見。
　　不健康飲食是另一關(guān)鍵的“致肥胖環(huán)境”，因此飲食干

3、預(yù)同樣至關(guān)重要。富含初榨橄欖油的地中海飲食對(duì)健康有諸多益處，被認(rèn)為能降低冠心病發(fā)病率和死亡率、代謝綜合征發(fā)病率等。羥基酪醇(hydroxytyrosol，HT)作為初榨橄欖油中的主要多酚類成分，是一種天然抗氧化劑，具有顯著的抗炎、抗氧化應(yīng)激作用。肥胖狀態(tài)下營養(yǎng)負(fù)荷導(dǎo)致的細(xì)胞應(yīng)激是驅(qū)動(dòng)其他旁路信號(hào)進(jìn)而導(dǎo)致慢性炎癥、胰島素抵抗(insulin resistance，IR)、脂質(zhì)代謝障礙等代謝并發(fā)癥的病理生理基礎(chǔ)，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙被認(rèn)為是重

4、要的整合因素。因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERs）及其與代謝通路之間的廣泛聯(lián)系和交互作用可能為治療肥胖相關(guān)的代謝障礙提供靶點(diǎn)，然而，目前尚未見關(guān)于HT對(duì)ERs及其下游炎癥、胰島素信號(hào)的作用及其機(jī)制研究。本實(shí)驗(yàn)旨在通過飲食誘導(dǎo)肥胖(diet-induced obesity，DIO)小鼠的運(yùn)動(dòng)及飲食干預(yù)實(shí)驗(yàn)，第一，研究兩種不同的運(yùn)動(dòng)處方對(duì)青春期肥胖小鼠減重、脂質(zhì)代謝、糖穩(wěn)態(tài)及脂肪組織能量代謝的

5、作用，并探討潛在的機(jī)制;第二，研究HT干預(yù)對(duì)肥胖相關(guān)并發(fā)癥IR、慢性炎癥及肝臟脂質(zhì)代謝障礙的影響，并結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)探究ERs在其中發(fā)揮的重要作用。
　　目的:
　　1.通過運(yùn)動(dòng)干預(yù)后身體測(cè)量指標(biāo)、組織水平分析、糖脂及能量代謝分子水平分析，對(duì)HIIT和MICT兩種運(yùn)動(dòng)方式對(duì)肥胖小鼠的干預(yù)作用作一比較;并通過肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因及其調(diào)節(jié)因子表達(dá)的檢測(cè)，胰島素敏感組織胰島素信號(hào)、炎癥信號(hào)通路的分析，棕色脂肪產(chǎn)熱活性及白色脂肪組織棕色

6、化的比較，揭示HIIT改善機(jī)體肥胖及糖脂質(zhì)障礙的作用機(jī)制;
　　2.通過H旰預(yù)后肥胖小鼠全身及組織炎癥和IR改變，肝臟和脂肪組織的ERs水平變化以及肝臟脂質(zhì)代謝改變，結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)探究HT通過ERs作用于炎癥通路、胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和肝臟脂質(zhì)代謝通路的信號(hào)級(jí)聯(lián)。
　　方法:
　　1.DIO小鼠模型的建立:100只ICR小鼠給予高脂飲食(high fat diet，HFD)，另10只小鼠給予低脂飼料喂養(yǎng)。7周后，將HFD組

7、中體重高于低脂飲食組平均體重20％的小鼠入選為DIO模型進(jìn)行運(yùn)動(dòng)及飲食干預(yù)，運(yùn)動(dòng)干預(yù)分為靜坐(SED)組、HIIT組、MICT組，飲食干預(yù)分為HFD組、HFD+HT組，各組10只并繼續(xù)予HFD喂養(yǎng)，10只低脂飲食小鼠作為對(duì)照組(CON)繼續(xù)予低脂飼料喂養(yǎng);
　　2.運(yùn)動(dòng)干預(yù)部分:(1)跑臺(tái):小鼠跑臺(tái)機(jī)傾斜角度25°，皿T組小鼠予10組×4min高強(qiáng)度(85～90％VO2max)跑步訓(xùn)練，間歇期2min(跑帶速度5m/min);MI

8、CT小鼠跑步總距離與HIIT組相等，持續(xù)強(qiáng)度為65～70％VO2max。每周訓(xùn)練5日（周一～周五），干預(yù)8周，SED組不予任何處理;(2)定期稱重，記錄食水?dāng)z入量，處死后脂肪組織稱重，計(jì)算體脂率;通過內(nèi)臟白色脂肪組織(visceral white adipose tissue，vWAT)石蠟切片蘇木素伊紅(hematoxylin and eosin，H&E)染色，定量比較脂肪細(xì)胞體積;(3)全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血脂指標(biāo):總膽固醇(tot

9、al cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)，高密度脂蛋白膽固醇(high-density-lipoprotein cholesterol，HDL-c)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-c)和肝功指標(biāo):丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotrans ferase，ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotrans

10、ferase，AST)，全自動(dòng)特種蛋白分析儀檢測(cè)超敏C反應(yīng)蛋白(high-sensitivity C reactive protein，hsCRP)水平，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清中炎癥因子(IL-6、脂聯(lián)素)水平，ELISA法檢測(cè)血清中胰島素水平;(4)通過肝組織石蠟切片H&E染色觀察肝臟組織學(xué)變化;組織提取液測(cè)定肝臟中TG含量;通過RT-qPCR檢測(cè)脂質(zhì)β-氧化相關(guān)酶(CPT-I、HAD)及其轉(zhuǎn)錄因子PPARα的基因表達(dá)，脂質(zhì)合成調(diào)節(jié)酶(A

11、CC、FAS、SCD-1)及轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c的基因表達(dá);蛋白質(zhì)免疫印記(Western blotting，WB)法檢測(cè)PPARα及SREBP-1的蛋白表達(dá);透射電鏡分析肝臟細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量、面積及形態(tài);(5)通過糖耐量試驗(yàn)(glucose to lerance test，GTT)和胰島素耐受試驗(yàn)(insulin tolerance test，ITT)評(píng)估全身葡萄糖耐量及胰島素敏感性，通過空腹血糖、胰島素水平計(jì)算HOMA-IR值;

12、免疫熒光法(immuno fluo rescence，IF)檢測(cè)vWAT中巨噬細(xì)胞浸潤程度(F4/80+細(xì)胞數(shù));通過WB法檢測(cè)vWAT中炎癥通路(p-c-Jun/JNK1、IKKβ、TNFα、IL-1β)、胰島素信號(hào)通路(ps-IRS-1/IRS-1、p-Akt/Akt、GLUT4)標(biāo)記蛋白;(6)通過肩胛間棕色脂肪組織(interscapular brown adipose tissue，iBAT)大體形態(tài)及組織學(xué)免疫組化染色(UC

13、P1)，比較BAT產(chǎn)熱活性;通過對(duì)vWAT及腹股溝皮下白色脂肪組織(subcutaneous WAT，scWAT)免疫組化染色(UCP1)和棕色化標(biāo)志蛋白(UCP1、PRDM16)檢測(cè)，通過透射電鏡觀察scWA線粒體數(shù)量及形態(tài)改變，分析運(yùn)動(dòng)后不同部位WAT的棕色化反應(yīng);
　　結(jié)果:
　　運(yùn)動(dòng)干預(yù)部分
　　1.運(yùn)動(dòng)組小鼠雖能量攝入高于SED組，但運(yùn)動(dòng)干預(yù)后體重明顯低于SED組，且HIIT組小鼠體重顯著低于MICT組，體重

14、下降也較MICT組更顯著(P=0.001);運(yùn)動(dòng)組小鼠脂肪含量和體脂率明顯低于SED組，且HIIT組低于MICT組(P分別為0.010，0.002);MICT組內(nèi)臟脂肪細(xì)胞體積較SED無明顯改變，而HIIT組內(nèi)臟脂肪細(xì)胞體積明顯小于SED組和MICT組（P均為0.000）;
　　2.運(yùn)動(dòng)組小鼠血清ALT和TG水平顯著低于SED組，而只有HIIT組的TC和LDL-C水平明顯低于SED組（P分別為0.000，0.002）;
　　

15、飲食干預(yù)部分
　　1.相比三蒸水灌胃組，H旰預(yù)組小鼠空腹血糖、胰島素水平，HOMA-I值、AUCGTT和AUCITT均顯著下降;血清中炎癥因子hsCRP、IL-6水平顯著下降;肝臟和脂肪組織中ERs標(biāo)志蛋白p-PERK、p-IRE、ATF6、GRP78表達(dá)均顯著下降，炎癥通路及胰島素信號(hào)通路均有所改善，vWAT中巨噬細(xì)胞標(biāo)記物F4/80表達(dá)顯著減少;PA刺激HepG2細(xì)胞誘導(dǎo)ERs，HT預(yù)處理同樣能顯著下調(diào)ERs標(biāo)記物及改善IRS

16、1/Akt通路，且HT在100μM濃度時(shí)作用效果與ERs抑制劑4-PBA相仿;用SP600125抑制JNK后，HT對(duì)胰島素受體通路的改善作用消失;
　　2.相比三蒸水灌胃組，HT灌胃組小鼠體重、體脂含量、體脂率無明顯改變，但肝臟組織脂滴沉積及TG含量明顯減少，ER腫脹擴(kuò)張明顯緩解，肝臟脂質(zhì)合成轉(zhuǎn)錄因子SREBP1c的mRNA及蛋白水平，其下游分子ACC、FAS、SCD1的mRNA水平均顯著下調(diào);PA刺激HepG2細(xì)胞誘導(dǎo)ERs，H

17、T預(yù)處理同樣能顯著下調(diào)ERs標(biāo)記物及SREBP1，且HT在100μM濃度時(shí)作用效果與ERs抑制劑4-PBA相仿。
　　結(jié)論:
　　運(yùn)動(dòng)干預(yù)部分
　　1.HIIT在減輕體重、減少脂肪含量、減小內(nèi)臟脂肪細(xì)胞體積方面更有優(yōu)勢(shì);
　　2.HIIT更有利于降低血脂及肝臟脂質(zhì)沉積;機(jī)制:通過修復(fù)HFD引起的肝臟脂質(zhì)代謝基因損傷和線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷;
　　3.HIIT更有利于改善全身及脂肪組織糖穩(wěn)態(tài)和慢性炎癥狀態(tài);機(jī)制:

18、通過改善胰島素信號(hào)通路和炎癥信號(hào)通路(JNK/IRS1);
　　4、HIIT更有利于增強(qiáng)iBAT的產(chǎn)熱活性及誘導(dǎo)scWAT的棕色化。
　　飲食干預(yù)部分
　　1.HT能改善肥胖小鼠的全身慢性炎癥、糖穩(wěn)態(tài)及IR，改善胰島素敏感組織的胰島素受體通路及炎癥通路;
　　2.HT能通過緩解ERs改善胰島素受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，部分由IRE1α/JNK/IRS1通路介導(dǎo);
　　3.HT能通過緩解ERs降低肝臟脂質(zhì)合成通路相關(guān)基因