生物樣品中海洛因代謝物穩(wěn)定性研究.pdf

1、目的:
　　 1.建立血液和尿液中海洛因主要代謝物M3G、嗎啡和O6的固相萃取-液相色譜-串級質(zhì)譜(SPE-LC-MS/MS)方法;
　　 2.通過動物實驗完成空白添加血液和海洛因中毒血液中海洛因主要代謝物的保存穩(wěn)定性研究;
　　 3.通過人體實驗完成健康人尿液空白添加和海洛因吸食者尿液中海洛因主要代謝物的保存穩(wěn)定性研究。
　　 方法:
　　 1.海洛因主要代謝物固相萃取方法的研究
　　

2、對檢材預(yù)處理后，采用BAKERBONDTM spe Octadecyl(C18)3cc500mg固相萃取柱進行提取，分析了不同pH值緩沖液條件、不同洗滌劑以及不同洗脫溶劑對海洛因主要代謝物固相萃取回收率的影響，完成固相萃取方法的優(yōu)化。
　　 2.海洛因主要代謝物L(fēng)C-MS/MS檢測方法條件優(yōu)化的研究
　　 對液相流動相、液相色譜柱、采集時間等進行LC-MS/MS檢測方法條件優(yōu)化;采用保留時間(Rt)、多反應(yīng)檢測(MRM)

3、及內(nèi)標(biāo)法來對血液和尿液中海洛因主要代謝物進行定性定量分析。
　　 3.血液尿液中海洛因主要代謝物（M3G、嗎啡、O6）穩(wěn)定性研究
　　 取新鮮兔子空白血液和空白健康人體尿液作為檢材，分別復(fù)制為均含M3G、嗎啡和O6濃度均為200ng/mL的血液和尿液樣本，通過對檢材提取凈化處理后，檢測其在9個不同時間點、3個不同保存溫度（20度、4度、-20度）下M3G、嗎啡和O6的含量，研究其保存穩(wěn)定性規(guī)律。
　　 ①毒性動物

4、實驗毒性動物模型建立:選取3只體重相當(dāng)?shù)男坌酝米樱ㄈ毡炯兎N大耳兔），禁食24小時后，耳緣靜脈注射海洛因的生理鹽水5mg/kg兩小時后，頸動脈插管，負(fù)壓真空管采血。②人體實驗檢材來源于日常辦案中所獲確定為只吸食海洛因者的不同人的尿液4份。③將所獲3份血液和4份尿液分別復(fù)制為0.4mL血液和0.9mL尿液若干份，放置并監(jiān)測9個不同時間點、3個不同保存溫度（20度、4度、-20度）下M3G、嗎啡和O6的含量，研究其保存穩(wěn)定性規(guī)律。
　　

5、 驗證實驗取空白兔子血液和空白健康人體尿液各一份，一份未知濃度的已經(jīng)部分分解為嗎啡的O6標(biāo)準(zhǔn)溶液。將血液和尿液分別復(fù)制為合適濃度的血液和尿液樣品若干份后，分別檢測其存放在20度、4度、-20度條件下，0-14天(0、1、3、7、14)的嗎啡和O6的含量。
　　 結(jié)果:
　　 1.測得尿液中M3G、嗎啡、O6-單乙酰嗎啡的最低檢測限(LOD)分別為1.24pg、6.71pg、0.47pg;血液中M3G、嗎啡、O6-單乙酰

6、嗎啡的最低檢測限分別為1.50pg、8.21pg、0.52pg。
　　 2.本文所建立的固相萃取方法，適用于血液、尿液檢材，對兩者有很好的凈化富集作用;本文所建立的LC-MS/MS法，目標(biāo)物質(zhì)峰形良好，重復(fù)性好、檢測時間為8.5min。
　　 3.血液尿液中海洛因主要代謝物（M3G、嗎啡、O6）穩(wěn)定性結(jié)果
　　 空白添加血液組 O6:20度下，第14天O6組分百分比由初始的34.37％變?yōu)?.97％，4度下變?yōu)?

7、.10％，-20度下變?yōu)?4.26％。O6含量分別平均下降了97.51％、96.78％和49.73％。Morphine:第180天，4度和-20度下，嗎啡組分百分比分別由初始的38.02％變?yōu)?6.73％和66.49％。 M3G:第14天，20度、4度、-20度下，M3G組分百分比分別由初始的27.61％升高至41.04％、40.29％、33.88％。
　　 毒性動物血液組 O6:第14天，B、C組，20度、4度、-20度條件下

8、，O6組分百分比由初始的5.90％和1.66％，分別變化為0.06％、0.14％、1.66％和0.10％、0.19％、0.22％。 Morphine:第14天，A、B、C組，20度、4度和-20度的條件下，嗎啡組分百分比分別由初始的8.64％、6.07％、38.02％，分別變化為2.10％、4.19％、5.36％和0.63％、1.52％、3.34％及0.88％、2.62％、4.68％,Morphine含量平均分別下降了84.28％、63

9、.10％和38.85％。 M3G:第14天，A、B、C組，20度、4度和-20度的條件下，M3G組分百分比分別由初始的89.18％、88.02％、91.29％，分別變化為97.52％、95.56％、94.42％和99.31％、98.34％、95.00％及99.01％、97.20％、95.10％.
　　 空白添加尿液組 O6:第28天，20度下，O6組分百分比由初始的36.81％變?yōu)?.08％，4度下變?yōu)?0.39％，-20度下變

10、為28.29％，O6含量分別下降了99.78％、71.77％和23.15％。Morphine:第28天，20度、4度和-20度的條件下，嗎啡組分百分比分別由初始的42.62％變?yōu)?4.21％、56.26％和41.19％，嗎啡含量分別上升了45.96％、32.00％和3.36％。M3G:第180天，4度和-20度下，M3G組分百分比由初始的20.57％變化為24.22％和20.33％。
　　 吸食海洛因者尿液組 O6:A、B、D組

11、，第28天，O6組分百分比由初始的0.04％、0.989％和2.74％均變?yōu)?。Morphine:第180天，A、B、C、D、E組，4度和-20度，嗎啡組分百分比分別由初始的8.32％、7.22％、5.57％、5.79％和11.07％，分別變化為15.65％、12.41％;13.59％、14.22％;13.04％、12.41％;20.99％、16.37％和21.88、19.88％。M3G:第7天，20度、4度和-20度下，M3G組分百分

12、比分別由初始的91.64％、91.79％、94.41％、91.47％和87.67％，分別變化為90.95％、94.05％、94.76％;91.29％、91.72％、91.81％;94.26％、94.24％、93.94％;93.81％、92.16％、92.73％和86.90％、86.14％、87.53％。
　　 驗證實驗組①空白添加血液組:第14天，室溫下，嗎啡組分百分比由初始的11％變化為100％，O6組分百分比由初始的89％變

13、為0;-20度下，嗎啡組分百分比變至29％，O6組分百分比變至71％。②空白添加尿液組:第14天，室溫下，嗎啡組分百分比由初始的1％變化為22％，O6組分百分比由初始的99％變?yōu)?8％;-20度下，嗎啡、O6組分百分比均沒有明顯變化。
　　 結(jié)論:
　　 1.①采用Atalantis(R)HILIC Silica液相柱(2.1mm×150mm×3um)，前接phenomenex保護柱（DIKMA公司，美國），出峰效果比C

14、18柱好，因此采用前者色譜柱;液相流動相中均加入0.1％甲酸，可保證目標(biāo)物峰形的對稱性;在目標(biāo)物出峰最佳狀態(tài)下，采集時間最短可縮小至8.5分鐘。LC-MS/MS條件優(yōu)化后建立的方法，檢測結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏、重現(xiàn)性好，能達到定性定量分析的要求。②本實驗采用C18柱、MCX和CSGAU柱分別做為固相萃取小柱，平行操作，發(fā)現(xiàn)C18柱絕對回收率最高，重現(xiàn)性好。因此本文采用C18柱為固相萃取小柱對檢材進行提取凈化。③本文所建立的SPE-LC-MS/M

15、S法，提取回收率、線性范圍、檢測靈敏度均達到血液和尿液中M3G、嗎啡和O6的檢驗要求，可應(yīng)用于甄別是否吸食海洛因或海洛因中毒（死）案件的法醫(yī)學(xué)檢驗、法醫(yī)毒物動力學(xué)和穩(wěn)定性研究。
　　 2.血液尿液中海洛因主要代謝物穩(wěn)定性規(guī)律
　　 血液樣品 O6含量下降;嗎啡含量升高;M3G含量穩(wěn)定、略升高。
　　 尿液樣品 O6含量下降;嗎啡含量升高;M3G含量相對穩(wěn)定。
　　 驗證實驗組空白添加血液組:無論室溫和-2