sHLA-G5在腎移植受者體內(nèi)表達的臨床實驗研究.pdf

1、研究證明人類白細胞抗原-G(human leukocyte antigen-G，HLA-G)最初發(fā)現(xiàn)子母胎界面，免疫學家們證實其是保護胎兒免受母體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視與排斥的作用機制之一。HLA-G是一種免疫耐受分子，通過多種途徑參與免疫應答而發(fā)揮免疫抑制功能，因此逐漸成為器官移植領域關注的熱點。研究證實HLA-G與器官移植排斥反應和移植物功能良好具有相關性。HLA-G包括膜型和可溶型，其中可溶型HLA-G5(soluble human le

2、ukocyte antigen-G，sHLA-G)是結構和功能較為明確的亞型。sHLA-G5是否能夠作為判斷腎移植預后的生物標志分子，以及sHLA-G5的濃度與其效應關系，腎移植早期抗IL-2受體單克隆抗體是否影響sHLA-G5的表達，目前國內(nèi)外尚未見報道。本課題就此展開研究。
　　 首先，本研究把215例腎移植受者分為腎功穩(wěn)定組(F組，n=173)、急性排斥組(AR組，n=42)，健康供者為對照組(H組，n=69)。結果顯示，

3、術前、術后腎移植受者外周血中，mHLA-G1在CD4+、CD8+、CDI9+和CD16+56+各淋巴細胞亞群的表達比率均較低，且各組間差異無統(tǒng)計學差異。術前sHLA-G5表達在F、AR、H三組分別平均為33.43±21.46ng/ml、31.90±20.12ng/ml和24.94±13.19ng/ml，進行組間比較，F(xiàn)組sHLA-G5水平高于H組，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。而F組和AR組兩組間差異無統(tǒng)計學意義(p<0.05），

4、H組和AR組兩組間差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。在腎移植術后為期12周的動態(tài)觀察，F(xiàn)組sHLA-G5的表達水平高于AR組，并且移植腎組織組化顯示，21例腎移植受者發(fā)生急性排斥反應中17例HLA-G5表達陰性。經(jīng)ROC曲線得出，sHLA-G5水平預測急性排斥反應的最適cutoff值為139.0ng/ml，其敏感性和特異性均較高。同時采用Western blot驗證sHLA-G5在H組、F組、AR組呈現(xiàn)不同水平的表達，F(xiàn)組表達逐漸增加，

5、明顯高于AR組。RT-PCR進一步分析F組和AR組腎移植受者體內(nèi)的sHLA-G5 mRNA水平，AR組的腎移植受者外周血sHLA-G5表達水平較低，其mRNA表達較低；F組術后HLA-G5 mRNA表達逐漸上調。
　　 215例腎移植受者按照CMV活動性感染與否分為CMV(+)和CMV(-)組，CMV(+)組和CMV(-)組外周血淋巴細胞上mHLA-G1呈低表達，CMV-pp65陽性時淋巴細胞mHLA-GI的表達無明顯變化。CM

6、V(+)組在CMV-pp65陽性期，即CMV活動性感染階段，外周血CD14+mHLA-G1+顯著升高，達到45.53±17.32％，轉陰后下降至10.22±5.78%。CMV(+)組的sHLA-G5表達水平明顯升高。sHLA-G5含量預測CMV活動性感染的最道cutoff值為202.9ng/ml，具有很高的診斷準確性。在CMV活動性感染的12例移植腎組織中10例HLA-G表達陽性。Westem blot驗證sHLA-G5的表達情況，CM

7、V（+）組的sHLA-G5表達明顯高于CMV(-)組，RT-PCR分析CMV(+)組和CMV(-)組的腎移植受者sHLA-G5的mRNA水平；顯示CMV(+)組高于CMV(-)組。
　　 其次，選擇原核表達系統(tǒng)，利用PCR技術獲得HLA-G基因，構建HLA-G5的原核表達載體PET28a-HLA-G，獲得重組表達質粒，實現(xiàn)在E.coli BL21(DE3)宿主菌中sHLA-G5的高效表達。獲取足夠蛋白，觀察不同濃度的原核表達sH

8、LA-G5蛋白對混合淋巴培養(yǎng)體系中T細胞增殖的影響，探索sHLA-G5的濃度與其效應關系，為臨床研究提供理論依據(jù)。9對活體腎移植供、受者間進行混合淋巴培養(yǎng)，CFSE標記混合淋巴培養(yǎng)體系中受者CD3+T細胞，7天后收集細胞分析增殖情況，結果表明構建的sHLA-G5蛋白能夠抑制同種異體T細胞的增殖，在混合淋巴培養(yǎng)體系中，當加入低于0.25μg/ml時，抑制作用隨著濃度的增加而增強，當達到1.0μg/ml，盡管抑制作用與對照組比較具有差異，但

9、并非與濃度呈正相關。進一步流式細胞術分析發(fā)現(xiàn)，CD4lowT細胞、CD8lowT細胞的比率隨著sHLA-G5濃度的增加，CD4+T、CD8+T細胞增殖受到抑制，但細胞發(fā)生了變化，CD4lowT細胞、CD8lowT細胞所占比率明顯增加。
　　 最后，探討抗IL-2R單克隆抗體應用對sHLA-G5表達的影響，并且分析sHLA-G5的產(chǎn)生及水平上調是否為抗IL-2受體單克隆抗體一個新的作用機理。結果顯示首劑抗IL-2R單克隆抗體使用后

10、，即可誘導促進sHLA-G5的表達。腎移植術后ld、4d、lw、2w，抗體使用組受者的sHLA-G5的表達水平明顯高于未使用抗體組。另外，術前首劑抗IL-2R單克隆抗體的應用影響腎移植受者外周血中的細胞因子的轉換，IFN-γ、TNF-α明顯減低，IL-10升高，提供了利于sHLA-G5表達上調的微環(huán)境。2劑應用后IL-10、IL-4升高，造成腎移植受者外周循環(huán)中Th2占優(yōu)勢。
　　 以上結果證明：在腎移植受者外周血中，HLA-G

11、在腎移植受者外周血中的主要表達亞型為sHLA-G5。術后腎功穩(wěn)定組的sHLA-G5水平高于健康對照組和急性排斥組。ROC曲線分析得出sHLA-G5水平139.0 ng/ml作為cutoff閾值，具有很好的判斷急性排斥反應發(fā)生的意義。ROC曲線分析得出sHLA-G5水平202.9 ng/ml作為cutoff閾值，具有很好的判斷CMV活動性感染的價值。CMV(+)組腎移植受者在減低甚至停用免疫抑制劑后，移植腎功能仍良好。其可能機制為：CMV

12、(+)組sHLA-G5在外周血的表達水平顯著升高，移植物腎小管上皮細胞的HLA-G陽性表達提示sHLA-G5的表達保護移植腎功能。原核表達系統(tǒng)表達HLA-G5蛋白，鎳親和層析柱獲得了純度較高的HLA-G5蛋白，并有效復性獲得了純度達90%的sHLA-G5蛋白。原核表達的sHLA-G5在混合淋巴培養(yǎng)體系中的效應顯示與濃度相關性，在一定范圍內(nèi)，呈濃度依賴性，但并非呈正相關。當濃度高于1.0 ng/ml時，其抑制T細胞增殖能力沒有增強，而是出

13、現(xiàn)下降趨勢。sHLA-G5在混合淋巴培養(yǎng)體系中的效應顯示與濃度相關性，在一定范圍內(nèi)，呈濃度依賴性，但并非呈正相關。當濃度高于1.0 ng/ml時，其抑制T細胞增殖能力沒有增強，而是出現(xiàn)下降趨勢。在腎移植術后早期應用抗IL-2R單克隆抗體能夠誘導sHLA-G5的表達上調；抗IL-2R單克隆抗體影響腎移植受者外周血中的細胞因子的漂移，這種漂移的免疫方向利于移植物的保護，從而降低排斥反應發(fā)生的可能性。在腎移植術后早期應用抗IL-2R單克隆抗體