低劑量阿維菌素對家蠶的遺傳毒性研究.pdf

1、家蠶是經(jīng)過長期馴化的鱗翅目經(jīng)濟昆蟲，對農(nóng)藥十分敏感，抗藥性遠小于野外生存的害蟲。在蠶區(qū)農(nóng)林害蟲的化學防治過程中，農(nóng)藥可直接或間接地通過觸殺、胃毒、熏蒸等多種途徑造成家蠶中毒。阿維菌素(avermectin)是由灰色鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)發(fā)酵產(chǎn)生的一類十六元大環(huán)內(nèi)酯類化合物，其殺蟲機制是通過作用昆蟲神經(jīng)元突觸或神經(jīng)肌肉突觸的γ-氨基丁酸(GABA)受體，刺激GABA釋放，從而干擾正常的神經(jīng)活動，造成昆蟲

2、麻痹、拒食并最終死亡。由于阿維菌素具有高效、廣譜的特點，已被廣泛應(yīng)用于鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等農(nóng)業(yè)害蟲的防治。家蠶對阿維菌素敏感性極強，蠶區(qū)時有該農(nóng)藥中毒引起蠶繭產(chǎn)量下降的事件發(fā)生。
　　 本學位論文主要研究了低劑量阿維菌素對家蠶生長發(fā)育、營養(yǎng)利用的影響;對幼蟲血細胞DNA的損傷;對血細胞基因表達的影響;對血液蛋白表達的影響，較全面地評價了低劑量阿維菌素對家蠶的遺傳毒性。
　　 1.基于阿維菌素對家蠶96 h急性毒性的試

3、驗結(jié)果，設(shè)置了1、2、4、8μg/L四個添毒劑量，評價了低劑量阿維菌素對家蠶生長發(fā)育、營養(yǎng)利用、吐絲結(jié)繭等生理過程的影響。結(jié)果表明:1μg/L阿維菌素對家蠶的生長發(fā)育、食物利用基本沒有影響，2、4、8μg/L阿維菌素會造成幼蟲體重、相對生長率、相對取食量、食物利用率、食物轉(zhuǎn)化率、單繭重等指標下降，且下降程度與阿維菌素添毒劑量呈正相關(guān)。
　　 2.采用SCGE方法分析了1、2、4μg/L阿維菌素對家蠶4齡幼蟲血細胞DNA的影響，通

4、過觀察添毒后第1、3、5、7、9天DNA的彗星表現(xiàn)來評價阿維菌素對家蠶血細胞DNA的損傷效應(yīng)和遺傳毒性。彗星尾部DNA％和尾距的數(shù)據(jù)分析表明:與對照組相比，1、2、4μg/L阿維菌素對家蠶血細胞DNA均有明顯的損傷作用，且損傷程度與添毒劑量呈正相關(guān);在整個添毒過程中，尾部DNA％和尾距在處理后第3天達到最大值，然后開始下降，第9天達到本次實驗的最小值，整體表現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢。實驗結(jié)果說明了低劑量阿維菌素對家蠶血細胞DNA具有遺

5、傳毒性，能夠造成血細胞的損傷，且損傷程度與添毒劑量和添毒時間相關(guān)。
　　 3.采用RAPD方法分析了1、2、4、8μg/L阿維菌素對家蠶4齡幼蟲血細胞DNA的變異。添毒96 h后基因組DNA分析結(jié)果為:24條RAPD引物擴增產(chǎn)生的清晰條帶總數(shù)為143條，其中多態(tài)性條帶19條，多態(tài)性帶數(shù)比率為13.29％。用Ntsyspc2.1軟件計算出不同阿維菌素處理組樣品血細胞DNA間的遺傳相似系數(shù)分布在0.867～0.993，樹狀聚類圖顯示

6、對照組樣品與1、2、4μg/L3個處理聚為一類，8μg/L處理單獨聚為一類，說明8μg/L阿維菌素造成家蠶血細胞DNA的變異最大，即對血細胞DNA的損傷最嚴重。
　　 4.采用ACP-based PCR方法分析了家蠶4齡幼蟲血細胞在1μg/L阿維菌素壓力下的差異表達基因，篩選到15個表達差異在2倍或以上的基因。其中Ribosomal protein S18(DEG4)、ALY(DEG5)、Ribosomal protein S8

7、(DEG7)、Ribosomal protein L6(DEG8)、Ribosomal protein L23A(DEG9)、ERp57(DEG10)、QM(DEG11)、Ribosomal protein L35(DEG13)、Rad23(DEG14)、Ribosomal protein L11(DEG15)是上調(diào)表達基因;Polyubiquitin(DEG1)、ANT(DEG2)、Glycoprotein(DEG3)、Ribosom

8、al protein L7(DEG6)、Y-box(DEG12)是下調(diào)表達基因。推測其中一部分基因的差異表達與家蠶血細胞的DNA損傷或者損傷修復(fù)相關(guān)，還有一部分基因的差異表達是家蠶在阿維菌素壓力下的一種應(yīng)答表現(xiàn)。
　　 5.采用2-DE和MALDI-TOF/TOF方法分析了家蠶4齡幼蟲血液在1μg/L阿維菌素處理前后的蛋白表達特征。通過比對電泳圖譜發(fā)現(xiàn)5個差異蛋白，其中3個在處理組中下調(diào)表達，1個在處理組中上調(diào)表達，還有1個在對

9、照組中特異性表達。蛋白鑒定結(jié)果顯示:2號差異蛋白是一種血液蛋白(Hemolymph protein)，分子量為29.7 kD，屬于家蠶30 K蛋白家族成員，其功能是為幼蟲生長發(fā)育提供能量;3號差異蛋白是一種神經(jīng)系統(tǒng)特異蛋白前體(Bombyrin precursor)，分子量為22.5 kD，它可能與維持幼蟲神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性有關(guān)。4號差異蛋白是一種促進蛋白(Promoting protein，PP)，分子量為17.2 kD，推測可能與家蠶