pH值調(diào)節(jié)誘導(dǎo)鱷蛇鯔肌球蛋白分子展開(kāi)-折疊行為的研究.pdf

1、pH值調(diào)節(jié)法(pH-shifting)提取魚(yú)蛋白是魚(yú)糜生產(chǎn)新工藝,不僅能提高蛋白得率,在一定程度上還能改善蛋白質(zhì)的功能特性,但有關(guān)其功能特性的改善與結(jié)構(gòu)關(guān)系的研究還不夠系統(tǒng)深入。為此,本研究以鱷蛇鯔肌球蛋白為研究對(duì)象,從廣泛pH值條件(2.0-12.0)誘導(dǎo)鱷蛇鯔肌球蛋白去折疊行為入手,分析了極端酸/堿條件下不同酸、堿類型對(duì)肌球蛋白去折疊行為的影響,不同鹽濃度對(duì)酸/堿去折疊肌球蛋白的影響,最后分析了不同酸、堿類型誘導(dǎo)去折疊后兩種重折疊途

2、徑對(duì)肌球蛋白構(gòu)象影響。本文可為pH值調(diào)節(jié)法生產(chǎn)魚(yú)糜工藝提供理論依據(jù),對(duì)于認(rèn)識(shí)肌球蛋白分子去折疊和重折疊構(gòu)象變化,開(kāi)發(fā)功能性質(zhì)良好的水產(chǎn)蛋白具有指導(dǎo)作用。主要結(jié)果如下:
　　1、鱷蛇鯔肌球蛋白重鏈分子量為200 kDa,三種輕鏈分子量分別為18 kDa、22kDa和26 kDa,蛋白純度達(dá)到了97％,滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。在等電點(diǎn)處,肌球蛋白的表面疏水性最小。在近中性條件下總巰基含量最高(24.9 mol/105 g和11.3 mol

3、/105 g),酸堿性條件使總巰基含量下降。在等電點(diǎn) pH范圍內(nèi),肌球蛋白的表面疏水性、α-螺旋含量均小;極端酸性和堿性條件下表面疏水性與溶解性呈相同趨勢(shì),α-螺旋含量則相反。高鹽濃度(600 mmol/L KCl)使肌球蛋白的等電點(diǎn)向酸性方向偏移(5.0→4.0)。酸性pH值條件下,低鹽濃度下的肌球蛋白表面疏水性高于高鹽濃度;堿性pH值條件下,出現(xiàn)相反的結(jié)果。堿性條件更容易產(chǎn)生多聚體,并且多聚體主要由肌球蛋白分子的重鏈通過(guò)二硫鍵交聯(lián)產(chǎn)

4、生。
　　2、對(duì)于強(qiáng)酸,誘導(dǎo)肌球蛋白疏水性大小順序?yàn)辂}酸(HA)~硫酸(SA)>磷酸(PA);對(duì)于弱酸,其順序?yàn)闄幟仕?CA)>乳酸(LA)>醋酸(AA)。不同類型的酸對(duì)色氨酸熒光影響規(guī)律變化不明顯。LA處理的肌球蛋白α-螺旋含量最低,其它各酸處理之間差異不明顯。pH=2.0時(shí),三種有機(jī)酸(醋酸、乳酸和檸檬酸)處理的肌球蛋白總巰基含量低于三種強(qiáng)酸。酸的種類對(duì)肌球蛋白結(jié)構(gòu)的影響與pH值有關(guān)。堿性條件下,隨著pH值的增大,肌球蛋白表面

5、疏水性和色氨酸熒光呈相反趨勢(shì)。氨水處理組表面疏水性較KOH與NaOH處理組低,α-螺旋含量及色氨酸熒光較KOH與NaOH處理組高。KOH與NaOH處理對(duì)表面疏水性、色氨酸熒光、α-螺旋含量及總巰基含量的影響差異不明顯。NaOH及KOH對(duì)肌球蛋白結(jié)構(gòu)的影響不明顯。氨水使肌球蛋白變性程度最小。
　　3、在KCl濃度為0.4-0.6 mol/L范圍內(nèi),三種pH值條件下的肌球蛋白的溶解性均大于91.6%。KCl濃度大于0.6 mol/L時(shí)

6、,三種pH值條件下肌球蛋白溶解性均出現(xiàn)下降,其中中性及堿性條件下下降緩慢,酸性條件下幾乎不溶。在0-0.04 mol/L KCl范圍內(nèi),極端酸、堿性條件下肌球蛋白表面疏水性值大于中性(p<0.05);在鹽濃度>0.6 mol/L時(shí),堿性及中性條件下,肌球蛋白表面疏水性均隨鹽濃度增加而增加,且堿性條件下表面疏水性小于中性。在pH值為2.0時(shí),隨著鹽濃度增加總巰基含量有緩慢下降的趨勢(shì)。鹽濃度>0.6 mol/L時(shí),中性條件下總巰基含量出現(xiàn)了

7、下降,堿性條件則緩慢上升。電泳分析表明,堿性條件下鹽濃度的增加(0-0.6 mol/L)促進(jìn)了肌球蛋白大分子聚合物的形成。中性條件下,α-螺旋含量在0-0.2 mol/L KCl含量較低;中性及堿性條件下,鹽濃度>0.6 mol/L時(shí)α-螺旋含量隨鹽濃度增加而升高。微量DSC分析表明,各條件下肌球蛋白吸熱曲線在30-60 oC之間出現(xiàn)了兩個(gè)吸收峰,鹽濃度提高增加了第一轉(zhuǎn)變溫度。酸性條件下,鹽濃度的升高降低肌球蛋白的展開(kāi);中性及堿性條件鹽

8、濃度(>0.6 M)的升高促進(jìn)肌球蛋白的展開(kāi)。
　　4、不同種類酸、堿誘導(dǎo)的展開(kāi)-重折疊展肌球蛋白,其表面疏水性高于對(duì)照,色氨酸熒光強(qiáng)度、總巰基含量和α-螺旋含量均低于對(duì)照(p<0.05);堿性處理的肌球蛋白表面疏水性和α-螺旋含量高于酸性處理組,色氨酸熒光強(qiáng)度低于酸性組,總巰基含量與酸性處理組差異不明顯(p>0.05)。檸檬酸處理組肌球蛋白的表面疏水性和α-螺旋含量高于鹽酸處理組,色氨酸熒光低于鹽酸處理組,總巰基含量與鹽酸處理組

9、差異不明顯;酸性誘導(dǎo)展開(kāi)處理,IP重折疊處理組肌球蛋白的表面疏水性、總巰基含量和α-螺旋含量高于NP組,但色氨酸熒光強(qiáng)度差異不明顯。堿處理誘導(dǎo)肌球蛋白展開(kāi)-重折疊構(gòu)象與堿類型、pH值及重折疊途徑都密切相關(guān)。各pH值條件下,NaOH處理組的肌球蛋白色氨酸熒光強(qiáng)度高于KOH組,但α-螺旋含量低于KOH處理組。IP重折疊過(guò)程比NP處理具有更高疏水性值,更低的α-螺旋含量,但色氨酸熒光及總巰基含量差異不明顯。重折疊后的肌球蛋白熱變性溫度均低于對(duì)