pH值調(diào)節(jié)誘導(dǎo)羅非魚肌球蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化.pdf

1、pH值調(diào)節(jié)法（pH-shifting，酸/堿溶解-等電點沉淀法）是一種新型的動物蛋白質(zhì)提取方法，在低溫偏離蛋白質(zhì)等電點的極端酸性（pH≤3.0）或極端堿性（pH≥11.0）條件下使蛋白充分溶解，高速離心除去脂肪和不溶性雜質(zhì)制備可溶性蛋白溶液，然后在等電點條件下使蛋白沉淀并回收，制備魚分離蛋白（Fish Protein Isolates，F(xiàn)PI）。由于酸/堿法提取蛋白質(zhì)回收率高、脂肪含量低、環(huán)境的污染小、凝膠強度好、色澤較好且具有較好的貯

2、藏穩(wěn)定性而受到廣泛的關(guān)注，但提取過程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)變化的研究相對較少，如不同陰陽離子的選擇對pH值調(diào)節(jié)法的影響以及酸堿調(diào)節(jié)處理對肌球蛋白的結(jié)構(gòu)-功能的影響。
　　為此，本研究以羅非魚肉為原料，提取肌球蛋白，探討pH值調(diào)節(jié)處理過程中，肌球蛋白分子酸/堿去折疊、等電點和中性調(diào)節(jié)重折疊過程中分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化。其主要目的是進(jìn)一步了解pH值調(diào)節(jié)處理過程中分子構(gòu)象的動態(tài)變化，完善其基礎(chǔ)理論體系，為低值海洋蛋白制備技術(shù)體系的建立和新型功

3、能性分離魚蛋白的開發(fā)提供依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　　1.采用pH值調(diào)節(jié)（pH2.0-5.5、3.0-5.5、11.0-5.5、12.0-5.5）處理制備四種魚分離蛋白，分別提取其水溶性組分和鹽溶性組分，對其組成、溶解性、表面疏水性、總巰基和活性巰基含量、色氨酸熒光光譜、SDS-PAGE等進(jìn)行檢測和分析。結(jié)果表明：分離蛋白中鹽溶性組分比例高于水溶性組分比例（p<0.05），且堿提蛋白中鹽溶性蛋白的比例比酸提蛋白高（p<0.05）,

4、表明堿法更易蛋白的提??；分離蛋白中水溶性組分和鹽溶性組分的溶解性均受pH值的影響比較明顯，酸提蛋白的溶解性較堿提蛋白的低；與新鮮魚肉蛋白相比，四種分離蛋白中水溶性組分和鹽溶性組分均發(fā)生了變性，體系的表面疏水性增加、巰基含量降低、色氨酸熒光強度下降，且酸性條件下蛋白質(zhì)發(fā)生變性更嚴(yán)重；SDS-PAGE分析表明，肌球蛋白的變性最為明顯?？傮w分析可得，堿調(diào)節(jié)處理更有利于蛋白的提取。
　　2.以羅非魚肌球蛋白為原料，試驗不同的pH值和酸/堿

5、類型對肌球蛋白酸/堿溶解去折疊過程中分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化。研究表明：在廣泛pH值（pH2.0-12.0）范圍內(nèi)，肌球蛋白的溶解性受pH影響較明顯；在極端酸性（pH≤3.0）和堿性（pH≥11.0）條件下，肌球蛋白的溶解度為60.6％~76.65%，而在pH4.0~6.0時溶解度較低；酸/堿誘導(dǎo)肌球蛋白去折疊過程中，在偏離pH7.0時，肌球蛋白的表面疏水性逐漸增大、巰基含量逐漸減小、色氨酸熒光強度減弱、Ca2+-ATPase活性減小，這表

6、明肌球蛋白疏水基團暴露、分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，且肌球蛋白在堿性條件變性程度較酸性條件下弱;在pH7.0條件下處理時，Ca2+-ATPase活性為0.19μmol/mg/min，肌球蛋白變性程度較弱。
　　3.采用不同種類的酸誘導(dǎo)肌球蛋白去折疊，在HCl（pH2.0）處理條件下，表面疏水性最大、巰基含量最低、色氨酸熒光強大最小，肌球蛋白構(gòu)象變性較嚴(yán)重，而在C6H8O7（pH3.0）處理條件下，肌球蛋白構(gòu)象變化程度最弱；肌球蛋白在C6H8

7、O7和H3PO4（pH2.0）處理條件下，?-螺旋比例分別為20.5%和9%；不同種類的堿誘導(dǎo)肌球蛋白去折疊，NaOH（pH11.0）處理條件下的表面疏水性最小、巰基含量最高、色氨酸熒光強度最大、?-螺旋比例最高，肌球蛋白構(gòu)象變化程度最弱，此時肌球蛋白總巰基、活性巰基含量和?-螺旋比例分別為4.054 mol/105g、1.308 mol/105g和15.3%?？傮w分析可得，肌球蛋白在C6H8O7（pH3.0）、NaOH（pH11.0）

8、誘導(dǎo)下變性程度最弱。
　　4.進(jìn)一步研究酸/堿去折疊過程中 NaCl的添加濃度和順序?qū)α_非魚肌球蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的影響，研究表明，添加0.5mol/L的NaCl時，肌球蛋白的溶解性最好；肌球蛋白在 C6H8O7誘導(dǎo)去折疊過程中，NaCl的添加對疏水性影響不明顯（p<0.05）；但用H3PO4、NaOH、KOH誘導(dǎo)去折疊時，在去折疊之前加NaCl時疏水性指數(shù)最小、巰基含量最高、熒光強大最大，且去折疊前加NaCl，肌球蛋白在C6H8O7

9、、H3PO4（pH2.0）和NaOH、KOH（pH11.0）條件下，?-螺旋比例分別為47.9%、30.1%、38.4%和26.2%；去折疊后加NaCl，?-螺旋含量比例分別為31.2%、8.2%、13.1%和10.1%；這表明在用酸堿處理肌球蛋白溶液之前加NaCl能夠抑制其構(gòu)象的變化?？傮w分析可得，酸堿對肌球蛋白構(gòu)象的影響程度為：弱酸（C6H8O7）＜強酸（H3PO4），NaOH＜KOH。
　　5.將酸/堿變性肌球蛋白調(diào)節(jié)到中性

10、，考察重折疊過程中變性肌球蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化。研究表明：未經(jīng)酸/堿誘導(dǎo)重折疊的肌球蛋白溶解性明顯高于經(jīng)過酸/堿誘導(dǎo)重折疊的肌球蛋白溶解性，這表明經(jīng)過酸/堿誘導(dǎo)處理后，肌球蛋白發(fā)生變性；堿性條件（尤其是pH11.0）下處理的肌球蛋白溶解性在廣泛pH值（pH2.0-12.0）范圍內(nèi)最好；與酸/堿去折疊肌球蛋白相比，經(jīng)過酸/堿誘導(dǎo)重折疊后的變性肌球蛋白表面疏水性降低、巰基含量和Ca2+-ATPase活性增大、熒光強大增強，這表明酸/堿誘導(dǎo)部

11、分變性的肌球蛋白發(fā)生了重折疊。
　　6.采用不同種類的酸和堿誘導(dǎo)變性肌球蛋白重折疊，研究表明，堿調(diào)節(jié)不同種類的酸變性肌球蛋白，對H3PO4（pH11.0）去折疊的變性肌球蛋白，經(jīng)堿調(diào)節(jié)重折疊后?-螺旋比例為26.4%，肌球蛋白構(gòu)象變性較輕，而在HCl（pH2.0）去折疊的變性肌球蛋白，?-螺旋比例為14.9%，肌球蛋白構(gòu)象變化程度最嚴(yán)重；酸調(diào)節(jié)不同種類的堿變性肌球蛋白，NaOH（pH11.0）誘導(dǎo)去折疊的肌球蛋白構(gòu)象變性較輕，而在

12、KOH（pH12.0）誘導(dǎo)去折疊處理條件下，肌球蛋白構(gòu)象變化程度最嚴(yán)重。與去折疊肌球蛋白相比，經(jīng)pH值調(diào)節(jié)誘導(dǎo)重折疊后表面疏水性降低、巰基含量增大、熒光強大增強、?-螺旋比例增大，這表明當(dāng)把pH調(diào)回到中性時，部分變性的肌球蛋白發(fā)生重折疊。通過考查NaCl的添加順序在酸/堿重折疊過程中對變性肌球蛋白構(gòu)象的影響，研究表明，去折疊之前加NaCl時疏水性較小、巰基含量較高、?-螺旋比例較高。
　　總體研究顯示，酸/堿法提取蛋白質(zhì)過程中肌球