基于溫度馴化的淡水魚骨骼肌肌球蛋白功能性質(zhì)的變化及分子機(jī)理的研究.pdf

1、肌球蛋白約占魚肌原纖維蛋白質(zhì)的50％以上，它主要決定了魚肌肉蛋白質(zhì)的功能和性質(zhì)，進(jìn)而影響魚肌肉蛋白質(zhì)的加工適性。肌球蛋白分子由兩條重鏈亞基和四條輕鏈亞基組成。肌球蛋白重鏈的球狀頭部具有ATPase活性和與肌動(dòng)蛋白結(jié)合的能力；纖維狀的桿狀部分在生理性離子強(qiáng)度下具有形成絲狀的能力，并與魚肌肉蛋白質(zhì)的凝膠形成能力有關(guān)。本文選取廣溫性四大家魚中的草魚(Ctenopharyngodon idellus)和鰱魚(Hypophthalmichthys

2、 molitrix)作為研究對(duì)象，第一部分的研究工作主要考察了熱馴化條件下，草魚骨骼肌肌球蛋白熱穩(wěn)定性和動(dòng)態(tài)粘彈性的變化規(guī)律。第二部分的研究工作，通過(guò)RT-PCR法考察了已知的三種草魚肌球蛋白重鏈同工型基因在不同熱馴化階段草魚骨骼肌中的表達(dá)模式，旨在闡明草魚肌肉蛋白質(zhì)功能性質(zhì)伴隨環(huán)境溫度發(fā)生變化的分子機(jī)理。第三部分的研究工作主要通過(guò)RT-PCR法和3'-RACE法從冬季和夏季鰱魚的骨骼肌中分離到兩種肌球蛋白重鏈同工型基因，并通過(guò)Long

3、-PCR法對(duì)它們的輕酶解肌球蛋白的部分編碼序列進(jìn)行了cDNA克隆及氨基酸序列的推斷和解析。
　　 一.基于熱馴化的草魚骨骼肌肌球蛋白熱穩(wěn)定性和動(dòng)態(tài)粘彈性的變化
　　 對(duì)在30℃熱馴化條件下馴化不同時(shí)間的草魚骨骼肌肌球蛋白進(jìn)行提取和純化，通過(guò)SDS-PAGE電泳證實(shí)提取的肌球蛋白具有較高的純度。對(duì)在30℃熱馴化溫度下馴化不同時(shí)間的草魚肌球蛋白在40℃的熱變性溫度下的變性速率常數(shù)KD進(jìn)行了測(cè)定，證明肌球蛋白的熱變性符合一級(jí)變

4、性速率方程；研究結(jié)果顯示，草魚肌球蛋白的熱穩(wěn)定性明顯隨馴化時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，熱馴化77天的草魚肌球蛋白的熱穩(wěn)定性為未經(jīng)馴化草魚熱穩(wěn)定性的近33倍。
　　 通過(guò)差示掃描量熱儀(DSC)對(duì)未馴化和30℃馴化31天的草魚的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了測(cè)定和比較，研究結(jié)果表明，草魚肌球蛋白的熱穩(wěn)定性受熱馴化時(shí)間變化的影響，未馴化和30℃熱馴化31天的草魚肌球蛋白的熱轉(zhuǎn)化溫度(Tm)分別為37和43.6℃，表明兩者肌球蛋白的結(jié)構(gòu)可能不同，進(jìn)而證明了30

5、℃熱馴化草魚肌球蛋白的熱穩(wěn)定性優(yōu)于未經(jīng)熱馴化的草魚肌球蛋白。
　　 此外，通過(guò)測(cè)定不同熱馴化階段草魚肌球蛋白動(dòng)態(tài)黏彈性的變化，在流變學(xué)理論上證明淡水魚肌球蛋白的凝膠特性與熱馴化之間的關(guān)系。研究結(jié)果表明，草魚肌球蛋白的凝膠形成特性受熱馴化時(shí)間長(zhǎng)短的影響；未經(jīng)熱馴化的草魚肌球蛋白形成凝膠的溫度低于熱馴化49、63、77天的草魚，表明肌球蛋白的熱穩(wěn)定性越差，其形成凝膠的起始溫度亦越低。
　　 二.三種草魚肌球蛋白重鏈同工型基因

6、在不同熱馴化階段草魚骨骼肌中的表達(dá)模式
　　 通過(guò)RT-PCR法考察了草魚三種肌球蛋白重鏈同工型基因在不同熱馴化階段草魚骨骼肌中的表達(dá)模式，結(jié)果表明：熱馴化0-31天的草魚肌肉中主要表達(dá)低溫型(gc-10)的肌球蛋白重鏈同工型基因，而中間型(gcI)和高溫型(gc-30)的肌球蛋白重鏈同工型基因在熱馴化19-77天的草魚肌肉中都有表達(dá)，且高溫型(gc-30)表達(dá)量相對(duì)要多。據(jù)此，可以認(rèn)為熱馴化不同時(shí)間的草魚在肌球蛋白的性質(zhì)和功能

7、上展現(xiàn)的差異可能與肌球蛋白重鏈同工型基因的差異表達(dá)有關(guān)。
　　 三.鰱魚部分輕酶解肌球蛋白同工型基因的cDNA克隆
　　 通過(guò)RT-PCR法和3'-RACE法從冬季和夏季鰱魚的骨骼肌中分離到兩種肌球蛋白重鏈同工型基因，分別命名為低溫型(SC-W)和高溫型(SC-S)。兩種同工型基因的cDNA序列包含了部分3'-翻譯區(qū)和全部3'-非翻譯區(qū)，編碼了鰱魚輕酶解肌球蛋白(light meromyosin，LMM)羧基端的一部分氨

8、基酸序列。在終止密碼子的上游和下游區(qū)域，兩種同工型基因之間在核苷酸序列上顯示了明顯的差異，其序列同源性為79.5％，推斷的氨基酸序列的同源性為88.1％；根據(jù)與草魚和鯉魚相關(guān)同工型氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在15個(gè)氨基酸殘基位點(diǎn)上鰱魚低溫型(sc-w)與草魚10℃型(gc10)一致，但兩者顯示了與其它同工型不同的特有變異，并且其中的11個(gè)位點(diǎn)屬高度保守性殘基。這些結(jié)果似乎表明了基于低溫馴化的淡水魚表達(dá)的肌球蛋白重鏈同工型必須在它們的初級(jí)