淡水魚(yú)肌肉亮氨酸氨肽酶的分離純化與性質(zhì)研究.pdf

1、本文首次以鯉魚(yú)、草魚(yú)、鰱魚(yú)三種典型的淡水魚(yú)為原料，對(duì)其肌肉亮氨酸氨肽酶進(jìn)行分離純化，并研究了它們的酶學(xué)性質(zhì)，為L(zhǎng)AP在魚(yú)類肌肉中的生理學(xué)功能研究提供理論依據(jù)。 本文采用硫酸銨分級(jí)鹽析、DEAE-Sephacel離子交換層析、Sephacryl S-200凝膠過(guò)濾層析、羥基磷灰石層析、Phenyl Sepharose 6-Fast Flow疏水層析和 Econo-Pac Macro-Prep High Q離子交換層析等方法，從鯉魚(yú)

2、、草魚(yú)、鰱魚(yú)肌肉中分離純化得到LAP，分別命名為cmLAP(鯉魚(yú))，gmLAP(草魚(yú))和smLAP(鰱魚(yú))。 SDS-PAGE和凝膠過(guò)濾結(jié)果表明，純化的cmLAP、gmLAP和smLAP都是單體結(jié)構(gòu)，分子量約為105 kDa。三者的最適反應(yīng)溫度為35-40℃，熱穩(wěn)定性較差，最適pH為7.0-7.5。金屬螯合劑EDTA，EGTA和1,10-phenanthroline能有效抑制其活性，而其它抑制劑沒(méi)有明顯抑制作用，說(shuō)明三者都是金屬

3、蛋白酶。Bestatin，一種選擇性抑制氨肽酶的蛋白酶抑制劑對(duì)三者有強(qiáng)烈抑制作用。金屬離子對(duì)三種LAP作用存在細(xì)微的差別，但總體看來(lái)，Mg2+和Mn2+有輕微的激活作用，Co2+，Cu2+，Zn2+對(duì)酶都有不同程度的抑制作用。另外，巰基試劑對(duì)于保持酶活性是必不可少的。除了 Leu-MCA，酶對(duì)其它很多種氨基酸殘基也有一定分解作用，而對(duì)內(nèi)肽酶對(duì)應(yīng)的熒光底物和大分子量天然蛋白如肌原纖維蛋白和牛血清白蛋白沒(méi)有分解作用。以 Leu-MCA為底物