豬后腿肉中氨肽酶的分離純化與酶學(xué)特性研究.pdf

1、氨肽酶是從蛋白質(zhì)或肽鏈的氨基端選擇性切割氨基酸殘基的外肽酶，在肉類(lèi)貯藏與加工過(guò)程中，對(duì)風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的形成起著重要的作用。但國(guó)內(nèi)對(duì)豬肉中主要氨肽酶的研究還比較少，本文以豬后腿肉為原料，對(duì)其中的亮氨酰氨肽酶、丙氨酰氨肽酶和精氨酰氨肽酶進(jìn)行分離純化，并對(duì)它們的一些酶學(xué)特性進(jìn)行研究，為研究其對(duì)肌肉蛋白的水解能力及其在加工過(guò)程中的活力變化提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　本研究采用勻漿提取出粗酶液后，再通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀、Sephadex G-1

2、00凝膠過(guò)濾和henyl-Sepharose HP疏水層析等過(guò)程，從豬后腿肉中分離純化出高活力的丙氨酰氨肽酶、精氨酰氨肽酶和亮氨酰氨肽酶，對(duì)其進(jìn)行生物化學(xué)性質(zhì)的研究;確定了各個(gè)氨肽酶的最佳反應(yīng)溫度和pH值，然后研究了金屬離子、EDTA和EGTA等對(duì)氨肽酶活性的影響;并對(duì)氨肽酶的水解反應(yīng)進(jìn)行了研究，確定了氨肽酶對(duì)七種小分子肽的活力和作用方式。
　　研究結(jié)果表明:亮氨酰氨肽酶的得率為12.14％，純化了77.62倍;亮氨酰氨肽酶的最適

3、溫度為40℃左右，最適pH為7.0左右，Mg2+對(duì)酶活性有激活作用，Zn2+、Cu2+、Co2+、EDTA、EGTA對(duì)酶活性有抑制作用;Ca2+、Fe2+和Mn2+對(duì)亮氨酰氨肽酶活性的影響取決于離子濃度，濃度為0.5 mmol·L-1時(shí)對(duì)酶具有激活作用，而濃度為1.0 mmol·L-1時(shí)則表現(xiàn)為抑制作用。
　　丙氨酰氨肽酶純化了36.52倍，并且酶的回收得率達(dá)到了10.34％;最佳反應(yīng)溫度在50℃左右，最佳反應(yīng)pH值是在6.0左右

4、;對(duì)于Zn2+和Fe2+來(lái)說(shuō)，低濃度時(shí)的激活作用大于高濃度;Mg2+是隨著添加離子濃度的升高其抑制作用越大;Mn2+和EGTA隨著濃度增加，其抑制作用先升高后降低;Cu2+和EDTA對(duì)丙氨酰氨肽酶表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用，其抑制強(qiáng)度隨著濃度的增加而增人。
　　精氨酰氨肽酶的回收得率達(dá)到了10.94％，純化了107.46倍;最適反應(yīng)溫度為50℃左右，最佳反應(yīng)pH是6.0左右;Fe2+對(duì)精氨酰氨肽酶的活性有促進(jìn)作用，且隨著離子濃度的增加其

5、激活促進(jìn)越強(qiáng)，低濃度Mg2+抑制酶活性，高濃度激活酶活性;Mn2+對(duì)精氨酰氨肽酶表現(xiàn)為輕微的激活作用;Cu2+對(duì)精氨酰氨肽酶表現(xiàn)出了強(qiáng)烈的抑制作用，且隨著濃度的增加其抑制作用越強(qiáng)。螯合劑EDTA表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用，EGTA則表現(xiàn)為輕微的激活作川。
　　亮氨酰氨肽酶對(duì)Ala-His和Ala-Ala-Pro有水解能力，其活力不高，對(duì)Gly-Lys、Asp-His、Asn-Phe、Ser-Gly-Phe、Leu-Leu-Ala-His

6、不水解;對(duì)Ala-Ala-Pro的水解產(chǎn)物Aia-Pro也有一定的水解能力。丙氨酰氨肽酶不能水解Gly-Lys、Asp-His、Asn-Phe、Leu-Leu-Ala-His，能夠水解Ala-His、Ala-Ala-Pro和Ser-Gly-Phe，尤其對(duì)Ala-Ala-Pro的水解能力很高，活力達(dá)到99.5386U/mL，對(duì)其水解出來(lái)的二肽Ala-Pro也有很高的水解能力。精氨酰氨肽酶只水解Aia-His，且水解能力很小，對(duì)其它的小分子