豬骨免疫活性肽的酶解工藝及其分離純化的研究.pdf

1、本論文以鮮豬骨為原料，通過木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和Alcalase堿性蛋白酶等三種酶制備豬骨蛋白酶解產物，以小鼠脾淋巴細胞的增殖率為主要指標，參考水解度，根據單因素和正交試驗優(yōu)化酶解條件;對在最佳酶解條件下得到的豬骨蛋白酶解產物，通過超濾、凝膠過濾層析以及離子交換層析等分離純化技術進行分離純化以制備出免疫活性肽。主要研究結果如下:
　　木瓜蛋白酶的水解最佳條件為:時間4h、pH值5.5、酶底比7000 U/g、溫度55℃、底物濃度6

2、％，此時脾細胞增殖率為79.50％，水解度為18.25％;胰蛋白酶的水解最佳條件為:時間5h、pH值7.5、酶底比5000 U/g、溫度50℃、底物濃度6％，此時脾細胞增殖率為67.14％，水解度為21.25％; Alcalase堿性蛋白酶的水解最佳條件為:時間4h、pH值9.5、酶底比6000 U/g、溫度45℃、底物濃度6％，此時脾細胞增殖率為98.41％，水解度為16.82％。Alcalase堿性蛋白酶酶解后的產物脾細胞增殖率最高

3、。
　　豬骨蛋白酶解液采用截流分子量分別為2Ku、3Ku、5Ku、10Ku的超濾離心管進行分離，分離后得到的分子量分別為＞10Ku、5Ku～10Ku、3Ku～5Ku、2Ku～3 Ku和＜2Ku的5個肽段的組分，其中，分子量＜2Ku的肽段組分的脾細胞增殖率最高，其增殖率為100.89％。對超濾離心后分子量＜2Ku的肽段組分首先采用凝膠過濾層析接著再進行離子交換層析分離，其分離結果顯示:豬骨蛋白酶解液通過凝膠過濾層析之后被分為4個分離

4、峰（即4個組分），其中第2組分對小鼠脾淋巴細胞的增殖率最高，且劑量關系最明顯，當濃度在100μg/mL時，脾淋巴細胞的增殖率為109.83％。第2組分經離子交換層析后被分成了9個峰（即9個組分），其中第4組分增殖活性最強，且劑量關系最明顯，當濃度在100μg/mL時，脾淋巴細胞的增殖率為114.30％。對超濾后分子量＜2Ku的肽段組分首先使用離子交換層析接著再進行凝膠過濾層析分離，其分離結果顯示:豬骨蛋白酶解產物通過離子交換層析后被分成

5、了8個峰（即8個組分），其中第5組分增殖活性最強，且劑量關系最明顯，當濃度在100μg/mL時，脾淋巴細胞的增殖率為107.97％。第5組分經凝膠過濾層析后被分為5個峰（即5個組分），其中第3組分增殖活性最強，且劑量關系最明顯，當濃度在100μg/mL時，脾淋巴細胞的增殖率為110.95％。
　　通過比較兩種分離純化方法對豬骨蛋白酶解液的分離效果，可以確定最佳的分離純化方法為:豬骨蛋白的酶解產物首先進行超濾分離，然后再進行凝膠過濾