豬肺抑肽酶的分離純化及部分性質(zhì)研究.pdf

1、抑肽酶是一種非特異性、多功能蛋白酶抑制劑，廣泛應(yīng)用于臨床。目前的提取抑肽酶的方法主要是“二步法”，這種方法存在著污染大、成本高、周期長的缺點(diǎn)。為此，我們以交聯(lián)殼聚糖微球固定化胰蛋白酶，親和層析純化抑肽酶。傳統(tǒng)的提取原料主要是牛肺、人尿、胰蛋白酶結(jié)晶母液等。但從豬肺中提取抑肽酶，還未有文獻(xiàn)報(bào)道，我們?cè)囂叫缘貜呢i肺中提取抑肽酶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明： 1.用反相懸浮交聯(lián)法制備出粒度均勻的交聯(lián)殼聚糖微球，并用其固定化胰蛋白酶，制備新型固定化酶

2、，其最佳固定化酶的條件：用終濃度為0.6％的戊二醛，在50℃下，先處理交聯(lián)殼聚糖微球6h，再置冰浴中加酶為12mg/g，攪拌24h，固定化酶活性回收率達(dá)53.8％．固定化酶的最適溫度為80℃、最適pH為8、表觀米氏常數(shù)(K<,m>)為3.16MMl/L。與殼聚糖作為固定化酶載體相比，新型固定化酶具有吸附容量大、機(jī)械強(qiáng)度好、粒度均勻、耐酸堿、對(duì)牛血清白蛋白非特異性吸附較弱，洗脫時(shí)無明顯壓床現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)。 2.以新型固定化酶作為吸附劑

3、親和層析的牛肺抑肽酶比活力達(dá)到4308U/mg，純化倍數(shù)為350，略小于Sepharose 4B為載體固定化酶吸附劑的4593 U/mg，純化倍數(shù)為373。它們的提取效率相當(dāng)。與Sepharose 4B相比，以交聯(lián)殼聚糖微球作為親和層析吸附劑時(shí)，洗脫速度快，微球機(jī)械強(qiáng)度高，幾乎沒有壓床現(xiàn)象，且能反復(fù)使用。 3.用親和層析純化豬肺粗提液，結(jié)果表明，在用(0.5 mol/L，pH 1.5)氯化鈉一鹽酸溶液洗脫的收集液中，檢測(cè)到有抑制

4、活性，說明豬肺中也含有胰蛋白酶抑制劑。親和層析豬肺抑肽酶的最佳條件：固定化酶吸附劑的活力為1526.7U/g、經(jīng)80目篩的交聯(lián)殼聚糖微球載體、靜態(tài)吸附。 4.根據(jù)電泳圖可知，提取的豬肺抑肽酶為單一純品，相對(duì)分子量為11.1KDa，pH在1～ll范圍內(nèi)，處理12h，活性不變，但在pHl2以后活性就開始下降，當(dāng)pHl3時(shí)，活性為pH8．0時(shí)的89.7％，而且不同pH對(duì)豬肺抑肽酶的影響是可逆的；豬肺抑肽酶經(jīng)40～90℃水浴處理15mi