豬腎溶菌酶的分離純化及部分性質(zhì)與功能基團(tuán)研究和固定化初探.pdf

1、溶菌酶(Lysozyme EC3.2.1.17)是一種專門作用于微生物細(xì)胞壁的糖苷水解酶，全稱為1，4—β—N—溶菌酶，又稱胞壁質(zhì)酶(Mucopeptide)或N—乙酰胞壁酰基水解酶(Mucopeptide N—acetymuramoy hydrolase)。它能水解細(xì)菌堅(jiān)韌的細(xì)胞壁，使菌體失去保護(hù)的屏障而死亡，因而具有溶化細(xì)菌的作用。溶菌酶廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，現(xiàn)在還可以通過(guò)基因工程的手段獲得溶菌酶。溶菌酶被廣泛應(yīng)用于食品的殺菌

2、、保鮮、防腐上；在醫(yī)藥和臨床上，溶菌酶具有抗菌、預(yù)防病毒、消炎消腫、增強(qiáng)抗菌素療效等作用；還可以作為生化試劑用于細(xì)菌細(xì)胞破壁等。 以豬腎為材料，經(jīng)過(guò)勻漿、正丁醇除脂、硫酸銨分級(jí)分離、CM—Sepharose Fast Flow離子交換柱層析、Sephacryl S-200凝膠過(guò)濾等步驟，分離純化出電泳純的溶菌酶，該酶比活為162.45U/mg，純化倍數(shù)達(dá)113.6倍，回收率為16.89％。經(jīng)凝膠過(guò)濾和SDS—PAGE測(cè)得該酶的全

3、分子量約為15kD。其米氏常數(shù)Km為0.0135g/ml。以溶壁微球菌溶液為底物，測(cè)得該酶的最適pH為6.0，最適溫度為45℃。Ba2+、Zn2+、Li+等離子對(duì)該酶活性基本無(wú)影響，Mn2+對(duì)該酶活性有激活作用，Ag+、Cu2+、CO2+、Pb2+和Fe2+對(duì)該酶活性有抑制作用。在試驗(yàn)的幾種化學(xué)試劑中，雙氧水的抑制作用最強(qiáng)，其次是抗壞血酸，EDTA和尿素。用甲醇、乙醇、乙二醇和異丙醇四種有機(jī)物來(lái)檢測(cè)它們對(duì)酶活力的影響，結(jié)果表明甲醇對(duì)其酶

4、活抑制程度較為顯著，異丙醇次之，乙二醇相對(duì)比較輕微，而乙醇對(duì)其酶活基本無(wú)太大影響。 在一定條件下分別采用苯甲基磺酰氟(PMSF)，三硝基苯磺酸(TNBS)、對(duì)氯汞苯甲酸(PCMB)，二巰基蘇糖醇(DTT)、N—溴代琥珀酰亞胺(NBS)、順丁烯二酸酐(maleicanhydride)、溴乙酸(BrAc)、碘乙酸(IAc)8種化學(xué)修飾劑選擇修飾豬腎溶菌酶的多種氨基酸殘基，并測(cè)定其酶活力變化。結(jié)果表明，N—溴代琥珀酰亞胺、對(duì)氯汞苯甲酸

5、的修飾能顯著抑制酶的活力，活力的降低與修飾劑的濃度有關(guān)。三硝基苯磺酸和順丁烯二酸酐也能抑制酶活力，但是不明顯。溴乙酸、碘乙酸和二巰基蘇糖醇的修飾對(duì)酶的抑制作用影響較小。因此認(rèn)為巰基和色氨酸殘基是豬腎溶菌酶的必需功能基團(tuán)。 選擇聚乙烯醇-海藻酸鈉聚合物為載體，采用包埋法固定化豬腎溶菌酶，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)觀察了海藻酸鈉的濃度、酶量、氯化鈣濃度、戊二醛濃度和固定化時(shí)間對(duì)酶活回收率的影響，得到固定化溶菌酶最佳條件為：2％海藻酸鈉，1：2的

6、載體與酶液(Ⅴ/Ⅴ)比例，0.04mol/LCaCl2，0.25％戊二醛交聯(lián)2h，酶活力回收率達(dá)到80.3％。固定化酶的最適溫度為45℃，與游離酶相同，最適pH值為6.0，也與游離酶相同，且有更寬的適宜反應(yīng)的范圍。將固定化酶儲(chǔ)存于4℃冰箱中一個(gè)月活性比較穩(wěn)定性，仍能保持在70％以上。 由于溶菌酶和幾丁質(zhì)酶作用機(jī)理的不同，溶菌酶能抑制枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉的生長(zhǎng)，而幾丁質(zhì)酶能抑制啤酒酵母和假絲酵母菌的生長(zhǎng)。而兩者對(duì)大