牛肝堿性磷酸酶的分離純化、部分性質(zhì)和功能基團(tuán)及固定化研究.pdf

1、本文以新鮮的牛肝為材料，經(jīng)勻漿、Tris-HCl緩沖液抽提、正丁醇除脂、熱變性、超濾、DEAE-Sepharose離子交換柱層析、Sephacryl S-200凝膠過(guò)濾層析，分離純化出牛肝堿性磷酸酶，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)該酶已達(dá)到電泳純。純化倍數(shù)達(dá)228.74倍，比活為19863.50U/mg.經(jīng)SDS-PAGE和凝膠過(guò)濾測(cè)得該酶的亞基分子量為59 Kd，全分子量為118 Kd。以磷酸苯二鈉為底物，測(cè)得該酶的最適

2、pH為10.0，最適溫度為45℃。Na+、K+、Li+等一價(jià)離子對(duì)該酶活性基本無(wú)影響，Mg2+對(duì)該酶活性有激活作用，Cu2+、Zn2+、Ca2+、Fe2+、Mn2+對(duì)該酶活性有抑制作用，Km為1.12mmol/L。
　　 分別采用對(duì)氯汞苯甲酸(PCMB)、乙酰丙酮(BD)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二巰基蘇糖醇(DTT)、琥珀酸酐(SUAN)、N-溴代琥珀酰亞胺(NBS)、碘乙酸(IAc)這七種化學(xué)修飾劑，在一定條件下選擇性的修

3、飾牛肝堿性磷酸酶的氨基酸側(cè)鏈，結(jié)果表明：DTT、SUAN、NBS、IAc這四種化學(xué)修飾劑能顯著的抑制牛肝堿性磷酸酶的活力，并且酶活力的降低與修飾劑濃度的成正相關(guān)。而DTT、SUAN、NBS、IAc能選擇性的修飾蛋白質(zhì)中的二硫鍵、ε-氨基、色氨酸殘基、組氨酸殘基。因此我們認(rèn)為，ε-氨基、色氨酸殘基、組氨酸殘基是牛肝堿性磷酸酶活性中心所必需的功能基團(tuán)，而二硫鍵對(duì)于維持酶活性中心的結(jié)構(gòu)也是必需的。
　　 分別采用海藻酸鈉、聚乙烯醇-海

4、藻酸鈉為載體固定牛肝堿性磷酸酶。對(duì)兩種載體固定化方法的單因素實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行了正交優(yōu)化試驗(yàn)。再對(duì)兩種方法下的固定化酶進(jìn)行性質(zhì)研究，通過(guò)實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定出兩種固定化酶的最適溫度、最適酸堿度和儲(chǔ)存穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：通過(guò)海藻酸鈉固定法的實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化，確定海藻酸鈉的最適濃度為1％，海藻酸鈉與酶液的最適比例為3∶1，氯化鈣的最適濃度為0.5％，固定化酶在氯化鈣中放置的最適時(shí)間為30min。通過(guò)海藻酸鈉固定法的正交優(yōu)化試驗(yàn)，確定CA∶AKP的最

5、佳水平為3∶1，CA濃度最佳水平為2％，氯化鈣濃度的最佳水平為0.2％。海藻酸鈉固定法的酶回收率最高可以達(dá)到80％。海藻酸鈉固定化酶的最適溫度為45℃，最適pH值為pH9.5，在30天內(nèi)，固定化酶的剩余酶活力達(dá)到了75％.說(shuō)明海藻酸鈉固定化酶在4℃下具有較好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。通過(guò)聚乙烯醇-海藻酸鈉固定法的實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化，確定聚乙烯醇的最適濃度為1％，海藻酸鈉的最適濃度為1％，聚乙烯醇-海藻酸鈉與酶液的最適比例為4∶1，氯化鈣的最適濃度為0.5

6、％，固定化酶在氯化鈣中放置的最適時(shí)間為30min。通過(guò)聚乙烯醇-海藻酸鈉固定法的正交優(yōu)化試驗(yàn)，確定PVA濃度的最佳水平為1.5％，氯化鈣濃度的最佳水平為0.2％、CA濃度最佳水平為1.5％，PVA-CA∶AKP的最佳水平為4∶1，聚乙烯醇-海藻酸鈉固定法的酶回收率最高可以達(dá)到95.1％。聚乙烯醇-海藻酸鈉固定化酶的最適溫度為40℃，最適pH值為10.5。在三十天內(nèi)，固定化酶的剩余酶活力達(dá)到了94％.說(shuō)明PVA-CA固定化酶在4℃下具有良