氧化還原敏感mPEG-PLGA-DTX結(jié)合物膠束的研究.pdf_第1頁(yè)
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1、癌癥死亡率與發(fā)病率逐年增高,已成為世界范圍內(nèi)的一大健康問(wèn)題。多西他賽(docetaxel,DTX)是紫杉烷類(lèi)抗癌藥,其作用機(jī)制是抑制微管蛋白解聚,從而阻斷腫瘤細(xì)胞增殖。多西他賽抗癌譜較廣,可以用來(lái)治療肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌,治療效果是紫杉醇的2-4倍。但是其水溶性較差,臨床注射液應(yīng)用吐溫80增溶,易引起毒副反應(yīng);其分布無(wú)特異性,易引起全身毒性。此外,由于紫杉烷類(lèi)藥物的大量使用,導(dǎo)致癌癥細(xì)胞對(duì)紫杉烷類(lèi)藥物產(chǎn)生了多藥耐藥(multi

2、-drug resistance,MDR)性,這成為DTX使用中的另一大問(wèn)題。癌癥細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的主要原因是細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白p-glycoprotein(p-gp)的過(guò)量表達(dá)。
  由于高分子科學(xué)的快速發(fā)展,應(yīng)用聚合物高分子作為藥物載體包載疏水性藥物以增加疏水藥物溶解性和治療效果的研究成為熱點(diǎn)。兩親性嵌段聚合物可以在水中聚集為膠束;膠束具有親-疏水核殼結(jié)構(gòu),內(nèi)核疏水而外殼親水,其疏水內(nèi)核可以包載疏水性藥物。聚合物膠束可以通過(guò)物理性包

3、埋和化學(xué)結(jié)合兩種方式包載藥物?;瘜W(xué)結(jié)合載藥是將藥物和聚合物嵌段通過(guò)化學(xué)鍵化學(xué)結(jié)合形成聚合物-藥物結(jié)合物(polymer-drug conjugate),藥物成為聚合物的一部分,參與膠束的組裝。此方法可以增加膠束的載藥量和穩(wěn)定性:還可利用環(huán)境敏感的化學(xué)鍵共價(jià)連接藥物和聚合物,起到在腫瘤部位集中釋放藥物,提高藥物療效的作用,這也是此類(lèi)藥物傳遞系統(tǒng)的一大創(chuàng)新點(diǎn)。腫瘤組織內(nèi)具有較低的pH值,特殊酶和較強(qiáng)的還原性環(huán)境,基于此特點(diǎn),可以采用pH敏感

4、、酶敏感和氧化還原敏感的化學(xué)鍵連接藥物,使聚合物具有環(huán)境敏感性質(zhì)。
  本課題成功合成了具有氧化還原敏感的聚合物-藥物結(jié)合物,使其在水中自組裝,并進(jìn)一步用于包載其他藥物。選擇兩親性聚合物甲氧基聚乙二醇-聚丙交酯乙交酯(mPEG-PLGA,PP)作為大分子骨架,通過(guò)氧化還原敏感的二硫鍵連接DTX,合成敏感的mPEG-PLGA-SS-DTX(PP-SS-DTX)結(jié)合物。利用此結(jié)合物進(jìn)一步包載多西他賽或維拉帕米(verapamil,VR

5、P),實(shí)現(xiàn)載藥體系功能多樣化。
  本課題研究包括以下幾個(gè)方面:
  1、PP-SS-DTX結(jié)合物的合成和表征:選擇含有二硫鍵的二硫代二丙酸(即DTDP)作為連接分子,通過(guò)三步化學(xué)反應(yīng)成功合成了PP-SS-DTX結(jié)合物,并通過(guò)熔點(diǎn)測(cè)定、核磁共振氫譜(1H-NMR)和傅立葉變換紅外色譜(FT-IR)驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)。此外,通過(guò)芘探針?lè)y(cè)定其臨界聚集濃度(critical aggregationconcentration,CAC),發(fā)

6、現(xiàn)PP-SS-DTX結(jié)合物的CAC值很小,為10.20μmol/L。
  2、氧化還原敏感型雙模式載多西他賽PP-SS-DTX/DTX膠束系統(tǒng)的評(píng)價(jià):通過(guò)透析法制備雙模式載多西他賽PP-SS-DTX/DTX膠束,雙模式是指同一體系中通過(guò)化學(xué)結(jié)合和物理包埋兩種模式包載DTX。通過(guò)TEM和DLS測(cè)定膠束的形態(tài)和粒徑,所制備的PP-SS-DTX/DTX膠束呈球形,粒徑為112.3nm; PP-SS-DTX/DTX膠束具有較高的載藥量,為

7、(14.65±0.71)%。通過(guò)溶血試驗(yàn)初步判斷PP-SS-DTX/DTX膠束具有一定生物相容性。為驗(yàn)證PP-SS-DTX/DTX膠束釋藥是否具有氧化還原敏感性,在釋放介質(zhì)中加入還原型物質(zhì)DTT。釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與DTX原料藥溶液相比,PP-SS-DTX/DTX膠束具有藥物緩釋、氧化還原敏感性釋藥和程序性釋藥的特點(diǎn)。選擇乳腺癌MCF-7細(xì)胞系和黑色素瘤B16F10細(xì)胞系進(jìn)行體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)。在兩種細(xì)胞系中,PP-SS-D

8、TX/DTX膠束的毒性作用均明顯強(qiáng)于DTX溶液。由于DTX不能發(fā)熒光,利用香豆素-6(coumarin-6,C-6)模擬疏水藥物DTX,制備了PP-SS-DTX/C-6膠束,通過(guò)熒光倒置顯微鏡技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)定性、定量的研究細(xì)胞對(duì)PP-SS-DTX/C-6膠束的攝取。結(jié)果表明,MCF-7和B16F10兩種細(xì)胞對(duì)PP-SS-DTX/C-6膠束的攝取效率高于C-6溶液。細(xì)胞對(duì)膠束制劑的高攝取效率,保證了藥物濃集于病變細(xì)胞,是提高抗腫瘤效果的

9、重要原因。
  3、PP-SS-DTX/VRP雙模式雙載藥膠束系統(tǒng)的抗腫瘤多藥耐藥的評(píng)價(jià):采用探頭超聲法制備PP-SS-DTX/VRP膠束,雙模式是指分別通過(guò)化學(xué)結(jié)合和物理包埋方式載藥,雙載藥是指一個(gè)膠束體系同時(shí)包載兩種藥物——多西他賽和維拉帕米。維拉帕米是有效的p-gP的拮抗劑,可與p-gp結(jié)合并使其失活,逆轉(zhuǎn)癌癥細(xì)胞的多藥耐藥。
  在制備膠束過(guò)程中,考察探頭超聲的超聲時(shí)間對(duì)維拉帕米的包封率與載藥量的影響,發(fā)現(xiàn)探頭超聲的

10、時(shí)間越短,維拉帕米的載藥量和包封率越高。通過(guò)TEM和DLS測(cè)定膠束的形態(tài)和粒徑,PP-SS-DTX膠束和PP-SS-DTX/VRP膠束均呈球形,粒徑分別為(79.3±1.2)nm和(78.3±4.6)nm。PP-SS-DTX/VRP膠束中DTX載藥量為(8.94±0.72)%,維拉帕米的載藥量為(5.66±1.60)%,包封率為(53.49±10.96)%。為驗(yàn)證膠束的體外釋放是否具有敏感性,在釋放介質(zhì)中加入DTT,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DTX和VR

11、P的釋放均具有氧化還原敏感性。為研究膠束的抗腫瘤多藥耐藥的作用,選擇乳腺癌MCF-7細(xì)胞和耐藥的乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞,進(jìn)行DTX溶液、PP-SS-DTX膠束和PP-SS-DTX/VRP膠束的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明,PP-SS-DTX膠束和PP-SS-DTX/VRP膠束對(duì)兩種細(xì)胞系的細(xì)胞毒性作用均好于 DTX溶液;此外,PP-SS-DTX/VRP膠束對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用強(qiáng)于PP

12、-SS-DTX膠束。由于DTX和VRP不能發(fā)熒光,因此選擇p-gp底物羅丹明123(rhodamine123,RH123)作為熒光分子對(duì)膠束進(jìn)行標(biāo)記研究細(xì)胞攝取情況和p-gp抑制效果。結(jié)果表明,MCF-7對(duì)PP-SS-DTX膠束和PP-SS-DTX/VRP膠束的細(xì)胞攝取效率相似,且均大于RH123溶液;MCF-7/人DR細(xì)胞對(duì)RH123幾乎無(wú)攝取,對(duì)PP-SS-DTX/VRP膠束的攝取大于對(duì)PP-SS-DTX膠束的攝取。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)表明

13、,PP-SS-DTX膠束和PP-SS-DTX/VRP膠束培養(yǎng)的細(xì)胞凋亡數(shù)目多于DTX溶液組。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PP-SS-DTX包載VRP后,可以抑制p-gp的作用,增強(qiáng)耐藥細(xì)胞對(duì)膠束的攝取,加快細(xì)胞凋亡的進(jìn)程,從而提高多西他賽的抗腫瘤效應(yīng)。
  4、PP-SS-DTX膠束體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇Wi star大鼠,通過(guò)尾靜脈注射給藥,利用HPLC法檢測(cè)大鼠血漿中DTX的含量。以DTX原料藥溶液作對(duì)照,觀察PP-SS-DTX膠

14、束的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過(guò)程,得到血藥濃度-時(shí)間曲線,并通過(guò)DSA2.0軟件對(duì)血藥濃度-時(shí)間曲線擬合,得PP-SS-DTX膠束房室模型和藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。將DTX制備成PP-SS-DTX膠束后,血藥濃度-時(shí)間曲線變平緩;通過(guò)對(duì)曲線擬合,發(fā)現(xiàn)DTX溶液和PP-SS-DTX膠束均符合二室模型。將DTX制備成PP-SS-DTX膠束后,體內(nèi)清除率降低,消除半衰期和體內(nèi)滯留時(shí)間延長(zhǎng),有利于藥物緩釋并保證藥物療效。
  綜上所述,本研究首次合成了具有氧化還原

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