黃酮化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制及其包埋物納米顆粒的理化性質(zhì)與生物活性研究.pdf

1、近年來，糖尿病，尤其是Ⅱ型糖尿病已經(jīng)成為危害人類生命的重大疾病之一。研究表明，α-葡萄糖苷酶的活性是產(chǎn)生餐后高血糖的關(guān)鍵因素，因而抑制α-葡萄糖苷酶的活性成為臨床降低餐后高血糖，治療2型糖尿病的主要途徑之一。由于臨床中用于治療糖尿病的主要藥物—阿卡波糖等會對不同的病人存在一定的副作用，因而使得其應(yīng)用受到限制。因此，尋找毒副作用低的天然中草藥有效成分作為新的α-葡萄糖苷酶抑制劑已成為當(dāng)前研究的趨勢。本論文采用紫外光譜法、熒光光譜法、同步熒

2、光光譜法和圓二色譜法(CD)以及分子模擬技術(shù)，研究山奈酚、楊梅素和染料木素等3種黃酮化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用、結(jié)合性質(zhì)及其對α-葡萄糖苷酶結(jié)構(gòu)的影響，探討了這3種黃酮化合物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制機(jī)制。由于黃酮化合物的不穩(wěn)定和易降解，為了提高黃酮化合物的穩(wěn)定性，保護(hù)其生物活性，本文研究應(yīng)用牛血清白蛋白/?-卡拉膠作為于黃酮化合物的包埋載體，對山奈酚、楊梅素或染料木素進(jìn)行包埋，構(gòu)建了黃酮化合物（山奈酚、楊梅素或染料木素）-牛血清

3、白蛋白/?-卡拉膠顆粒體系，分別考察了經(jīng)過牛血清白蛋白/?-卡拉膠顆粒包埋前后的山奈酚、楊梅素和染料木素的穩(wěn)定性及其對DPPH自由基的清除能力，研究了模擬胃腸道消化環(huán)境下黃酮化合物的釋放情況及其對α-葡萄糖苷酶的抑制能力。主要研究內(nèi)容和結(jié)果概述如下：
　　1、研究了山奈酚、楊梅素、染料木素對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，分別測定了山奈酚、楊梅素和染料木素對α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度(IC50)、抑制類型和抑制常數(shù)。結(jié)果表明，山奈酚

4、、楊梅素和染料木素都是可逆的α-葡萄糖苷酶抑制劑，并且3種黃酮對α-葡萄糖苷酶都有較好的抑制效果且都大于陽性對照阿卡波糖(IC50=(2.09±0.03)×10?4)，其半抑制濃度IC50值分別為(0.68±0.02)×10?5、(1.16±0.04)×10?5和(1.89±0.01)×10?5 mol L?1(n=3)，抑制α-葡萄糖苷酶能力依次為楊梅素>山奈酚>染料木素。山奈酚是一種混合型α-葡萄糖苷酶抑制劑，楊梅素為競爭型抑制劑，

5、染料木素呈現(xiàn)出非競爭型抑制，它們對α-葡萄糖苷酶抑制常數(shù)Ki分別為(1.31±0.03)×10?5、(1.59±0.04)×10?5和(1.26±0.02)×10?5(n=3)。
　　2、聯(lián)合應(yīng)用紫外和熒光光譜法并結(jié)合分子模擬手段研究了上述3種黃酮化合物與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合性質(zhì)。結(jié)果表明，山奈酚、楊梅素、染料木素都能很好的猝滅α-葡萄糖苷酶的內(nèi)源熒光，與α-葡萄糖苷酶結(jié)合，并且該3種黃酮與α-葡萄糖苷酶都只存在一個結(jié)合位點(diǎn)(n值

6、近似等于1)。由非輻射能量轉(zhuǎn)移理論計算出山奈酚、楊梅素、染料木素與α-葡萄糖苷酶結(jié)合距離r分別為3.05、3.25和2.61 nm，均小于臨界值8 nm，且0.5 R0R0，說明這3種黃酮可能處在α-葡萄糖苷酶發(fā)光基團(tuán)附近的位置，從而強(qiáng)有力的猝滅了酶的熒光。分子模擬結(jié)果顯示，山奈酚、楊梅素直接插入到α-葡萄糖苷酶的疏水空腔，通過疏水

7、作用和氫鍵范德華力與周圍的氨基酸殘基(Asp69, Phe178,Asp215, Glu277, His351,Asp352,Arg315,Phe314 and Val410)結(jié)合，占據(jù)了酶的活性中心，阻礙了底物硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)的進(jìn)入，從而對α-葡萄糖苷酶產(chǎn)生抑制作用。
　　3、采用同步熒光光譜法和CD光譜法研究山奈酚、楊梅素、染料木素與α-葡萄糖苷酶結(jié)合后對酶結(jié)構(gòu)的影響。發(fā)現(xiàn)隨著山奈酚、楊梅素、染料木素

8、的分別加入，α-葡萄糖苷酶的色氨酸和酪氨酸所處微環(huán)境有了微小的改變，并且α-葡萄糖苷酶的二級結(jié)構(gòu)α-Helix的含量均呈現(xiàn)增大趨勢，分別由30.8％增大到34.2%，32.2%到36.7%，31.5%到32.2%。表明山奈酚、楊梅素、染料木素與α-葡萄糖苷酶結(jié)合破環(huán)了酶的氫鍵網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使酶二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，阻礙酶活性中心的形成并且阻止底物的進(jìn)入，最終導(dǎo)致酶催化降低。該3種黃酮化合物誘導(dǎo)α-葡萄糖苷酶二級結(jié)構(gòu)變化是其抑制酶活性的另一原因。

9、
　　4、以牛血清白蛋白/?-卡拉膠為載體，分別制備山奈酚–牛血清白蛋白/?-卡拉膠顆粒、楊梅素–牛血清白蛋白/?-卡拉膠顆粒、染料木素–牛血清白蛋白/?-卡拉膠顆粒，牛血清白蛋白/?-卡拉膠顆粒平均粒徑為110±3 nm，且粒徑均一，電動勢為–35.2±0.2 mV。加入山奈酚、楊梅素、染料木素3種黃酮化合物后，其包埋物納米顆粒平均粒徑分別為136±4 nm、145±2 nm和121±2 nm，電動勢分別為–32.2±0.5 m

10、V、–40.5±0.3 mV和–27.8±0.4 mV。山奈酚、楊梅素、染料木素的包埋率分別為78.41%、89.67%和71.59%。3種黃酮與牛血清白蛋白/卡拉膠顆粒均有很強(qiáng)的結(jié)合能力，結(jié)合常數(shù)分別為1.67×105、2.60×105和0.85×105 L mol?1，結(jié)合蛋白質(zhì)的能力依次為楊梅素>山奈酚>染料木素，與黃酮化合物B環(huán)上的羥基數(shù)有關(guān)。經(jīng)過牛血清白蛋白/卡拉膠顆粒包埋的山奈酚、楊梅素和染料木素的穩(wěn)定性比游離的黃酮明顯提高

11、，但清除DPPH自由基的能力有所減弱，這可能是這些黃酮化合物與蛋白的內(nèi)部通過氫鍵和疏水作用力結(jié)合，阻止了黃酮提供H+以消除自由基。經(jīng)模擬胃腸道消化后，山奈酚、楊梅素、染料木素在胃液(pH2.0)消化過程中(0–4 h)的釋放量分別為9.76%、11.35%和8.92%。繼續(xù)經(jīng)過腸液(pH7.6)消化10 h后，3種黃酮在腸液中的釋放率分別為19.54%、46.74%和26.54%。該結(jié)果可能是由于消化環(huán)境pH值發(fā)生變化(由pH2.0–7