用于蛋白質(zhì)研究的新型四苯基乙烯衍生物的設(shè)計(jì)與合成.pdf

1、在研究生物分子的眾多技術(shù)中，熒光技術(shù)提供了一種直觀、可實(shí)時(shí)、原位和非侵入性的觀察，而且可以在分子水平上分析生物分子，研究復(fù)雜的生物結(jié)構(gòu)和過程。到目前為止，已有多種多樣的熒光材料被用于生物傳感器或生物成像領(lǐng)域。其中聚集誘導(dǎo)發(fā)光（Aggregation-Induced Emission，AIE）分子具有與傳統(tǒng)熒光分子不同的發(fā)光行為，其在溶液狀態(tài)下熒光微弱而分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)受限時(shí)熒光增強(qiáng)的獨(dú)特性能使其可被用于很多傳統(tǒng)熒光材料應(yīng)用受限的領(lǐng)域，且表現(xiàn)出

2、眾。因此設(shè)計(jì)開發(fā)新型的AIE分子并探索其在生物檢測和成像中的應(yīng)用成為一個(gè)前沿的、重要的研究課題。除了具備AIE性能，用于生物檢測與成像的熒光分子還需要滿足一些特殊要求，如水溶性、紅光發(fā)射、細(xì)胞相容性等，而現(xiàn)有適用于生物傳感和成像的AIE分子依然有限。此外，生物分子的種類繁多，現(xiàn)有生物探針僅適用其中極少一部分，還有許多生物分子亟待研究者們?cè)O(shè)計(jì)新型的特異性探針加以檢測。本論文以AIE型熒光探針設(shè)計(jì)合成為核心，以種類最多、結(jié)構(gòu)最復(fù)雜、功能最豐

3、富的生物分子——蛋白質(zhì)作為研究對(duì)象，選取其中的典型結(jié)構(gòu)開展研究。
　　氨基酸是蛋白質(zhì)的構(gòu)筑基元，盡管AIE型熒光分子在帶有巰基、羥基和酸性殘基的氨基酸檢測中已有文獻(xiàn)報(bào)道，但對(duì)堿性殘基氨基酸的檢測還是空白。本文通過用乙烯雙鍵連接AIE生色團(tuán)四苯基乙烯(TPE)和1，3-茚滿二酮（IND）的分子設(shè)計(jì)，利用橋聯(lián)雙鍵在氫氧根離子的作用下發(fā)生水解反應(yīng)導(dǎo)致TPE-IND分子原有的橙紅色發(fā)光減弱的現(xiàn)象，實(shí)現(xiàn)對(duì)兩種堿性氨基酸（精氨酸和賴氨酸）區(qū)別

4、于其它常見氨基酸的檢測。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，檢測反應(yīng)的產(chǎn)物在紫外光的作用下具有藍(lán)色熒光逐漸增強(qiáng)的行為。TPE-IND分子對(duì)氫氧根離子和紫外光兩種刺激同時(shí)具有熒光響應(yīng)的特點(diǎn)使其可被用作一種雙響應(yīng)的熒光探針。
　　血清蛋白是最典型的輸運(yùn)蛋白，其折疊—解折疊過程在功能發(fā)揮中起決定性的作用，本文選取牛血清蛋白(BSA)作為研究模型體系。用AIE-型熒光探針研究包括BSA在內(nèi)的血清蛋白的構(gòu)象變化有若干前期報(bào)道。本文采用陰/陽離子型AIE熒光探針

5、相結(jié)合的方法取得了新的研究結(jié)果，除了進(jìn)一步證明AIE-型熒光探針的可靠性、靈敏性、親/疏水作用在探針與BSA結(jié)合中的主導(dǎo)作用以及血清蛋白解折疊存在“熔球”中間態(tài)之外，貢獻(xiàn)了新的認(rèn)識(shí):(1)明確了一個(gè)正常折疊的蛋白質(zhì)分子僅結(jié)合一個(gè)探針分子，而且不論陰離子還是陽離子型探針都結(jié)合在亞區(qū)ⅡA這一特定的區(qū)域的結(jié)合方式。(2)通過對(duì)陰/陽離子探針與BSA形成的兩種復(fù)合物在溫度、變性劑等誘導(dǎo)下的解折疊和重新折疊行為進(jìn)行對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)在親/疏水主導(dǎo)作用

6、之外，靜電作用也有重要影響。(3)解折疊過程中，亞區(qū)ⅡA的輸水空腔被破壞，探針分子被釋放出來而使體系熒光減弱。同時(shí)原本處于蛋白質(zhì)內(nèi)部的亞區(qū)Ⅰ暴露到環(huán)境中，并傾向于結(jié)合陽離子型的熒光探針，從而導(dǎo)致陽離子型探針的熒光增強(qiáng)而陰離子型探針的熒光減弱。
　　多肽是構(gòu)成蛋白質(zhì)的功能片段，具有水溶性、細(xì)胞相容性和細(xì)胞膜透過性等功能。本文設(shè)計(jì)合成了一系列基于TPE的、帶有功能性多肽鏈的AIE-gen，在緩沖液中研究了各種AIE-gen的的臨界聚集

7、濃度和分散與聚集形態(tài)。利用Hela細(xì)胞驗(yàn)證了各種探針分子的細(xì)胞成像能力。在選用的三種多肽鏈中，含有較多堿性氨基酸殘基的肽鏈與四苯基乙烯衍生物構(gòu)成的探針能在高濃度下以粒子的形式較好的通過細(xì)胞膜分散到細(xì)胞質(zhì)中，并使細(xì)胞質(zhì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光。三氰基呋喃基團(tuán)及肽鏈修飾的四苯基乙烯分子發(fā)光波長在紅光波段范圍，能順利進(jìn)入到細(xì)胞中，并使細(xì)胞質(zhì)具有極強(qiáng)的紅色熒光信號(hào)。這表明具有特定序列的多肽其修飾的四苯基乙烯衍生物能夠?qū)⒎肿舆\(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)，達(dá)到對(duì)細(xì)胞進(jìn)行

8、熒光成像的效果。同時(shí)可以通過對(duì)四苯基乙烯衍生物發(fā)光性能的調(diào)控，實(shí)現(xiàn)紅色熒光成像的效果。
　　設(shè)計(jì)合成了分別以小分子抑制劑和AIE分子為識(shí)別單元和信號(hào)單元的、針對(duì)特定蛋白酶的熒光探針。選用兩種抑制劑結(jié)構(gòu):一個(gè)能夠結(jié)合各類絲氨酸蛋白酶，另一個(gè)結(jié)合特定絲氨酸蛋白酶。選用的AIE-gen包括藍(lán)色熒光的TPE和橙色熒光的乙烯基吡啶修飾的TPE衍生物。初步結(jié)果顯示結(jié)合酶前后探針熒光光譜沒有明顯變化。通過測定蛋白酶水解特定底物速率的變化，觀測探