核酸適配體介導(dǎo)的載有阿霉素的DNA四面體對MUC1陽性腫瘤細胞的靶向殺傷作用.pdf

1、目的:
　　化療是晚期腫瘤的主要治療手段，但傳統(tǒng)化療藥物的細胞毒性作用往往會引起全身的系統(tǒng)毒性反應(yīng)，降低患者的耐受程度，導(dǎo)致治療效果下降。靶向治療作為一種可以與腫瘤細胞靶向結(jié)合從而抑制腫瘤生長的治療手段，是克服傳統(tǒng)化療系統(tǒng)毒性的重要技術(shù)路徑之一。MUC1是一種跨膜糖蛋白，在多種腫瘤細 胞中過量表達，包括乳腺癌，肺癌，胃癌，結(jié)腸癌，前列腺癌，胰腺癌，卵巢癌等。MUC1在腫瘤的生長，代謝，轉(zhuǎn)移等方面也有一定的作用。除此之外在腫瘤細胞中

2、表達的MUC1的結(jié)構(gòu)與正常組織細胞中表達的MUC1不同，其糖基化程度較低，因此使得MUC1成為了一種具有一定腫瘤特癥性的靶標分子，為其在靶向治療的應(yīng)用中提供了生物學(xué)基礎(chǔ)。已經(jīng)有研究表明，針對MUC1的單克隆抗體、疫苗、小分子配體等手段在體外和體內(nèi)的腫瘤抑制實驗中，可取得一定的初步效果，但目前MUC1靶向治療的臨床轉(zhuǎn)化依然十分遙遠，因此有必要探索針對MUC1的新型靶向治療方法。核酸適配體（aptamer）是一類由寡聚核苷酸組成的具有高特異

3、性和親和性的小分子配體。與抗體相比，核酸適配體具有較低的免疫原性和較強的組織穿透性，并且制備過程簡便，因此具有極大應(yīng)用前景。DNA正四面體(Td)作為一種DNA納米結(jié)構(gòu)，其自組裝的特點使得該物質(zhì)具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、制備過程簡單、容易被功能性基團修飾的優(yōu)勢。已有研究表明，DNA正四面體可以作為一種藥物載體，可負載抗腫瘤藥物阿霉素(Doxorubicin，或Dox)。然而，目前尚未有研究報道將核酸適配體與DNA正四面體相偶聯(lián)構(gòu)建成為靶向藥物呈遞系

4、統(tǒng)。本研究通過將MUC1核酸適配體(Apt)與DNA正四面體相偶聯(lián)，構(gòu)建成為靶向性的阿霉素呈遞系統(tǒng)，并且在體外評估了該靶向載體是否能夠與MUC1陽性腫瘤細胞特異結(jié)合，以及是否能靶向性地對MUC1陽性腫瘤細胞產(chǎn)生細胞毒性。
　　方法:
　　利用堿基互補配對的原則，通過自組裝的方式，構(gòu)建出DNA正四面體以及與MUC1 aptamer相偶聯(lián)后的Apt-Td。通過用FAM熒光染料標記Apt-Td，利用流式細胞分析技術(shù)來檢測Apt-T

5、d是否可以特異性的與MUC1陽性腫瘤細胞結(jié)合。通過物理方法，將阿霉素載入DNA納米結(jié)構(gòu)，構(gòu)建成為載有阿霉素的DNA納米結(jié)構(gòu)(Apt-Dox，Td-Dox，Apt-Td-Dox)，評估其載藥率，并用于后續(xù)實驗。利用共聚焦成像技術(shù)，流式細胞分析技術(shù)以及細胞共培養(yǎng)來驗證Apt-Td-Dox在體外是否可以將阿霉素靶向呈遞給MUC1陽性腫瘤細胞，并且通過MTS法測定Apt-Td-Dox在MUC1陽性腫瘤細胞與MUC1陰性對照細胞中產(chǎn)生的細胞毒性。

6、
　　結(jié)果:
　　本實驗利用MUC1 aptamer和DNA正四面體通過自組裝的方式成功構(gòu)建了目標藥物載體Apt-Td，并對其進行了粒徑和Zeta電位的表征，Apt-Td的平均粒徑大小為12.38nm，其Zeta電位為-10.mV;流式細胞分析結(jié)果表明Apt-Td與本實驗所采用的游離MUC1 aptamer類似，可以選擇性地與MUC1陽性腫瘤細胞結(jié)合而基本不與MUC1陰性細胞結(jié)合;通過對三種DNA納米結(jié)構(gòu)載藥率的研究發(fā)現(xiàn)，A

7、pt-Td的載藥率是游離aptamer載藥率的25倍;細胞攝取實驗表明Apt-Td-Dox可以將阿霉素靶向呈遞至MUC1陽性腫瘤細胞而限制阿霉素在MUC1陰性細胞中的藥物積累;細胞毒性試驗表明，Apt-Td-Dox對MUC1陽性腫瘤細胞可以產(chǎn)生顯著的細胞毒性，并同時降低阿霉素對MUC1陰性細胞的毒性(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　利用MUC1 aptamer和DNA正四面體可構(gòu)建成具有靶向作用的藥物載體Apt-Td。體外