廣西小土窩螺的核糖體DNA和線粒體基因組學(xué)研究.pdf

1、本論文的第一部分應(yīng)用PCR擴(kuò)增和DNA序列分析方法，以采自廣西梧州、桂林、北海、河池、南寧和百色等地的小土窩螺為研究對(duì)象，對(duì)小土窩螺核糖體基因間隔區(qū)(ITS)進(jìn)行了DNA遺傳多態(tài)性及種系發(fā)育分析，以期找到小土窩螺分子分類(lèi)學(xué)、種群遺傳關(guān)系研究的遺傳標(biāo)記。結(jié)果表明：廣西各地區(qū)的小土窩螺ITS序列的相似性在95.7％-100％(ITS-1)及90.5％-100％(ITS-2)，而與其他椎實(shí)螺科的螺體的相似度均低于55％，這說(shuō)明廣西地區(qū)的小土窩

2、螺的種內(nèi)變異遠(yuǎn)小于與其他螺的種間差異，同時(shí)也說(shuō)明了ITS-1和ITS-2均可以作為種水平以上的遺傳變異標(biāo)記，可以用于小土窩螺與其他椎實(shí)螺之間的鑒定。
　　 本研究的第二部分建立了小土窩螺的特異性PCR鑒定方法。以已獲得的小土窩螺ITS-1基因序列，設(shè)計(jì)了小土窩螺的特異性引物GPu/GPd，，用疑似截口土蝸、橢圓蘿卜螺等作為對(duì)照螺。采用已建立的特異性PCR檢測(cè)方法對(duì)采自梧州、桂林、南寧等六地經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定的共108份小土窩螺樣品進(jìn)

3、行了檢驗(yàn)。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示最小DNA檢測(cè)量為0.12ng。本檢測(cè)方法具有特異、敏感、簡(jiǎn)便、快捷等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)小土窩螺的種類(lèi)的鑒定以及對(duì)吸蟲(chóng)類(lèi)鑒別診斷和分子流行病學(xué)調(diào)查具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
　　 本論文的第三部分研究了小土窩螺的線粒體rrnL基因和線粒體全基因組。第一節(jié)對(duì)廣西地區(qū)不同種群的小土窩螺線粒體的rrnL基因部分序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、SSCP分析、測(cè)序及分析，結(jié)果得到有效長(zhǎng)度為273bp的prrnL序列，其種群間變異為0-4.

4、9％。而種系發(fā)育分析顯示不能將小土窩螺不同的種群區(qū)分開(kāi)來(lái)，說(shuō)明其不適合作為小土窩螺的種群遺傳標(biāo)記。
　　 第二節(jié)完成了小土窩螺的線粒體全基因組序列測(cè)定及分析。在比較和分析肺腮亞綱的線粒體全基因組序列之后，利用coxl，rrnL，cox3，nadl和cytb共5個(gè)線粒體DNA小片段設(shè)計(jì)引物，采用長(zhǎng)PCR方法分別擴(kuò)增出長(zhǎng)度約2-7kb的5個(gè)有重疊序列的片段，經(jīng)克隆轉(zhuǎn)化和測(cè)序后獲得小土窩螺線粒體基因組的全序列，并對(duì)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及遺傳進(jìn)化

5、關(guān)系進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：小土窩螺的線粒體基因組全長(zhǎng)為13768bp，A+T含量為72.67％;小土窩螺線粒體全基因組由13個(gè)蛋白質(zhì)基因、2個(gè)rRNA基因、22個(gè)tRNA基因組成。小土窩螺的線粒體全基因組中存在較多的小片段重疊區(qū)和基因間隔區(qū)。蛋白編碼基因排序方式與已報(bào)道線粒體全基因組的基眼目、柄眼目的螺種完全一致，與柄眼目的螺種Albinariacoerulea僅是cox3和nad4基因位置顛倒，其他蛋白編碼基因排列方式完全一致。在13個(gè)

6、編碼蛋白質(zhì)的基因中，以ATG和ATA作為蛋白質(zhì)翻譯的起始密碼子；多數(shù)蛋白質(zhì)翻譯的終止密碼子為T(mén)AA，其次是TAG。
　　 以釘螺為外群，以線粒體DNA序列作為遺傳標(biāo)記，重構(gòu)了小土窩螺的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。結(jié)果顯示：小土窩螺單獨(dú)成一分支，與扁卷螺關(guān)系最近。
　　 本論文首次研究了小土窩螺的ITS及線粒體全基因組序列，研究結(jié)果不僅豐富了腹足綱螺類(lèi)的ITS及線粒體全基因組序列，同時(shí)為對(duì)吸蟲(chóng)中間宿主螺類(lèi)的遺傳進(jìn)化等方面的進(jìn)一步研究奠定