基因工程酶法高效再生ATP耦合生產(chǎn)谷胱甘肽.pdf

1、谷胱甘肽在醫(yī)藥領(lǐng)域、食品領(lǐng)域以及美容方面都有廣泛應(yīng)用。一直以來關(guān)于谷胱甘肽的生產(chǎn)方法、分離手段等的研究層出不窮，但是關(guān)于怎么提高谷胱甘肽的產(chǎn)量，因為生產(chǎn)條件限制、谷胱甘肽雙功能酶的產(chǎn)物抑制作用等原因，目前為止仍然是亟待解決的難題。
　　體外酶催化法生產(chǎn)谷胱甘肽的方法因為生產(chǎn)過程容易調(diào)節(jié)相關(guān)的各個因素，所以是近年來廣泛研究的一種簡單有效的生產(chǎn)方法，但是ATP供給問題是該方法的一個重要的限制條件，所以體外酶法生產(chǎn)谷胱甘肽目前還不能很有

2、效的應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。
　　本課題針對上述兩個問題分別進行研究，得到了明確的實驗結(jié)果:利用體外酶法耦合特定菌種來源的多聚磷酸激酶和谷胱甘肽合成雙功能酶兩種酶，最終實現(xiàn)簡單、高效率、低成本生產(chǎn)谷胱甘肽的目標(biāo)。課題中應(yīng)用的多聚磷酸激酶和谷胱甘肽合成雙功能酶的來源是研究成功的關(guān)鍵因素。
　　課題的研究內(nèi)容路線設(shè)計主要有以下幾點:
　　(1)查閱文獻分別對比各種菌種來源的多聚磷酸激酶(PPK)和谷胱甘肽合成雙功能酶(GS)的催化

3、效果和酶催化動力學(xué)參數(shù)，選擇對應(yīng)合適的基因ppk和gs。然后以選擇的合適基因片段為目的基因，構(gòu)建目的基因的重組載體，異源表達成功得到目的蛋白。SDS-PAGE蛋白電泳法作為目的蛋白是否成功表達的檢測手段，驗證ppk和gs對應(yīng)的催化酶PPK和GS的成功表達。
　　(2)用異源表達的高效低耗的多聚磷酸激酶(PPK)和產(chǎn)物抑制作用弱的谷胱甘肽合成雙功能酶(GS)做體外酶法耦合催化生產(chǎn)谷胱甘肽的嘗試。在初步嘗試成功的基礎(chǔ)上，優(yōu)化反應(yīng)體系中

4、各物質(zhì)的濃度，確立影響反應(yīng)的關(guān)鍵因素之后對反應(yīng)關(guān)鍵條件進行逐個優(yōu)化，最終得到耦合反應(yīng)的最適條件。優(yōu)化結(jié)果顯示，谷胱甘肽生產(chǎn)體系可以從30 mM擴大到50mM;在優(yōu)化得到的反應(yīng)條件下，與同類生產(chǎn)方法相比，GSH產(chǎn)量由8g·L-1提高到13 g·L-1，對應(yīng)轉(zhuǎn)化率為83.8％;與此同時，耦合反應(yīng)體系中外源ATP的加入量僅為體系需求總量的20％?？傊c前人研究成果相比，本課題使谷胱甘肽產(chǎn)量提高1倍，同時反應(yīng)底物成本降低67.9％，這對于工業(yè)

5、生產(chǎn)谷胱甘肽是一個重大突破。
　　(3)在上述研究成果顯著的基礎(chǔ)上，擴大耦合催化反應(yīng)體積繼續(xù)進行探索。首先對含有重組載體的菌株進行高密度發(fā)酵，高壓勻漿破胞得到大量的粗酶液。以粗酶液為催化載體，擴大耦合反應(yīng)體積到250mL。體積擴大后耦合反應(yīng)生成的GSH濃度仍能達到12.32g·L-1，對應(yīng)轉(zhuǎn)化率為80.24％。
　　本課題的突破點在于，運用Pasteurella multocida來源的谷胱甘肽合成雙功能酶GS產(chǎn)物抑制效應(yīng)弱