基因工程制藥

1、第二節(jié) 重組蛋白表達系統(tǒng),一、原核表達系統(tǒng),概念：廣義的原核表達，是指發(fā)生在原核生物內(nèi)的基因表達。狹義的原核表達，常出現(xiàn)于生物工程中。是指通過基因克隆技術(shù)，將外源目的基因，通過構(gòu)建表達載體并導入表達菌株的方法，使其在特定原核生物或細胞內(nèi)表達,一個完整的表達系統(tǒng)通常包括配套的表達載體和表達菌株。如果是特殊的誘導表達還包括誘導劑，如果是融合表達還包括純化系統(tǒng)或者Tag檢測等等。選擇表達系統(tǒng)通常要根據(jù)實驗目的來考慮，比如表達量高低，目標蛋白的

2、活性，表達產(chǎn)物的純化方法等等。,表達載體　　為了獲得高水平的基因表達產(chǎn)物，人們通過綜合考慮控制轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性及向胞外分泌等諸多方面的因素，設(shè)計出了許多具有不同特點的表達載體，以滿足表達不同性質(zhì)、不同要求的目的基因的需要。 　　通常關(guān)心的表達載體質(zhì)粒上的元件包括：啟動子、多克隆位點、終止密碼、融合Tag（如果有的話）、復制子、篩選標記或報告基因等。,啟動子　　啟動子的強弱是對表達量有決定性影響的因素之一。從轉(zhuǎn)錄模式上看有組

3、成型表達和誘導調(diào)控型表達。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的啟動子。,終止子　　轉(zhuǎn)錄終止子對外源基因在大腸桿菌中的高效表達有重要作用，即控制轉(zhuǎn)錄的RNA長度提高穩(wěn)定性，避免質(zhì)粒上異常表達導致質(zhì)粒穩(wěn)定性下降。放在啟動子上游的轉(zhuǎn)錄終止子還可以防止其他啟動子的通讀，降低本底。轉(zhuǎn)錄終止子有兩類，Rho因子作用下使轉(zhuǎn)錄終止mRNA和根據(jù)模版上的對稱序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)而終止mRNA。常見的是rrnB rRNA操縱子的T1T2串連轉(zhuǎn)錄終止子

4、。,核糖體結(jié)合位點　　啟動子下游從轉(zhuǎn)錄起始位點開始延伸的一段堿基序列，其中能與rRNA16S亞基3‘端互補的SD序列對形成翻譯起始復合物是必需的，多數(shù)載體啟動子下游都有SD序列，也有些載體沒有 。,原核表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點,優(yōu)點：其優(yōu)點在于能夠在較短時間內(nèi)獲得基因表達產(chǎn)物，而且所需的成本相對比較低廉。,缺點：原核表達系統(tǒng)還存在許多難以克服的缺點：如通常使用的表達系統(tǒng)無法對表達時間及表達水平進行調(diào)控，有些基因的持續(xù)表達可能會對宿主細胞產(chǎn)生毒

5、害作用，過量表達可能導致非生理反應，目的蛋白常以包涵體形式表達，導致產(chǎn)物純化困難；而且原核表達系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，表達產(chǎn)物的生物活性較低 。,,為克服上述不足，許多學者將原核基因調(diào)控系統(tǒng)引入真核基因調(diào)控領(lǐng)域，其優(yōu)點是 ①根據(jù)原核生物蛋白與靶DNA間作用的高度特異性設(shè)計，而靶DNA與真核基因調(diào)控序列基本無同源性，故不存在基因的非特異性激活或抑制 ②能誘導基因高效表達，可達105倍，為其他系統(tǒng)所不及； ③能嚴格調(diào)控基因表達，即不僅

6、可控制基因表達的“開關(guān)”，還可人為地調(diào)控基因表達量 因此，利用真核表達系統(tǒng)來表達目的蛋白越來越受到重視。目前，基因工程研究中常用的真核表達系統(tǒng)有酵母表達系統(tǒng)、昆蟲細胞表達系統(tǒng)和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)。,酵母表達系統(tǒng),酵母是一類低等的單細胞真核生物，作為一種外源基因的表達系統(tǒng)相對于其他表達系統(tǒng)的優(yōu)勢在于，它既具有真核細胞的特性又具有類似于原核細胞的生長特點。酵母系統(tǒng)包括多種細胞因子、多肽激素等。酵母系統(tǒng)表達外源基因的優(yōu)點在于原核表達系統(tǒng)

7、相比酵母是真核生物，可對表達的蛋白進行修飾，有利于保持生物產(chǎn)品的活性和穩(wěn)定性；而且可將表達系統(tǒng)的產(chǎn)物分泌到胞外不僅有利于產(chǎn)品的純化，還避免地表達系統(tǒng)的過度積累對宿主產(chǎn)生不利影響；而對哺乳動物細胞表達系統(tǒng)相比酵母更易于培養(yǎng)，可進行大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)，故在表達外源蛋白，特別是大分子真核生物蛋白方面得到了廣泛的應用。,酵母表達系統(tǒng)載體,酵母表達系統(tǒng)的載體一般用穿梭載體，穿梭載體可以在酵母和大腸桿菌中進行復制，它是由酵母野生型質(zhì)粒、抗性基因、宿主

8、染色體DNA上自主復制序列（ARS）、中心粒序列（CEN）、端粒序列（TEL）等組成的。酵母中用于表達外源基因的常用表達載體一般可以分為兩種，即整合體型表達載體和附加體型表達載體。,常用的酵母表達系統(tǒng),釀酒酵母表達系統(tǒng)甲醇營養(yǎng)性酵母表達系統(tǒng)裂植酵母表達系統(tǒng)在酵母中表達外源基因的步驟1、外源基因克隆2、轉(zhuǎn)化酵母菌3、篩選并鑒定轉(zhuǎn)化子4、外源蛋白的誘導表達,昆蟲細胞表達系統(tǒng),概念：昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)是目前國內(nèi)外十分推崇的真

9、核表達系統(tǒng)。利用桿狀病毒結(jié)構(gòu)基因中多角體蛋白的強啟動子構(gòu)建的表達載體，可使很多真核目的的基因得到有效甚至高水平的表達。BEVS應用于外源蛋白表達的主要優(yōu)點是：它具有真核表達系統(tǒng)的翻譯后加工能力，如二硫鍵的形成、糖基化及磷酸化等，使重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然蛋白；其最高表達量可達昆蟲細胞蛋白總量的50%；可表達非常大的外源性基因；具有在同一個感染昆蟲細胞內(nèi)同時表達多個外援金銀的能力；對脊椎動物是安全的。,桿狀病毒表達載體的構(gòu)建方法,

10、將目的基因克隆到合適的載體，置于桿狀病毒啟動子控制之下。用重組的轉(zhuǎn)移載體和相應的野生型或改造過的野生型桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細胞。篩選重組病毒。擴增病毒以進行大規(guī)模的蛋白生產(chǎn)。純化表達的外源蛋白。,哺乳動物細胞表達系統(tǒng),按照宿主細胞的類型，可將基因表達系統(tǒng)大致分為原核、酵母、植物、昆蟲和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)。與其它系統(tǒng)相比，哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的優(yōu)勢在于能夠指導蛋白質(zhì)的正確折疊，提供復雜的N型糖基化和準確的O型糖基化等多種翻譯

11、后加工功能，因而表達產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學功能方面最接近于天然的高等生物蛋白質(zhì)分子。從最開始以裸露DNA直接轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞至今的30余年間，哺乳動物細胞表達系統(tǒng)不僅已成為多種基因工程藥物的生產(chǎn)平臺，在新基因的發(fā)現(xiàn)、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能研究中亦起了極為重要的作用。本文主要從表達系統(tǒng)及其兩個組成部分——表達載體和宿主細胞等方面，簡要介紹哺乳動物細胞表達系統(tǒng)和相關(guān)的研究進展。,研究現(xiàn)狀,①部分蛋白在哺乳動物細胞中的表達已從實驗室研究

12、邁向生產(chǎn)或中試生產(chǎn)階段。②已有許多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳動物細胞系統(tǒng)表達和大量制備、生產(chǎn)。如人組織型血纖蛋白酶原激活因子、凝血因子Ⅷ、干擾素、乙肝表面抗原、紅血球生成激素、人生長激素、人抗凝血素Ⅲ，集落刺激因子等。有些產(chǎn)品已投入臨床應用或試用。③雖然經(jīng)過多年努力，哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的表達水平有大幅度增高，但從整個水平上看仍偏低，一般處在雜交瘤細胞單克隆抗體蛋白產(chǎn)率的下限，即1-30μg/l08細胞/24小時。有人認為其限速步驟

13、可囂是在工程細胞中(對于重組蛋白來講，常是異源的)，重組蛋白的分泌效率較低。,,1 表達載體 1．1 表達栽體的類型哺乳動物細胞表達外源重組蛋白可利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和病毒載體的感染。利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細胞需幾周甚至幾個月時間，而利用病毒表達系統(tǒng)則可快速感染細胞，在幾天內(nèi)使外源基因整合到病毒載體中，尤其適用于從大量表達產(chǎn)物中檢測出目的蛋白。根據(jù)進入宿主細胞的方式，可將表達載體分為病毒載體與質(zhì)粒載體。病毒載體是以病毒顆粒的方式，通過

14、病毒包膜蛋白與宿主細胞膜的相互作用使外源基因進入到細胞內(nèi)。常用的病毒載體有腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、semliki森林病毒(sFv)載體等。另外，桿狀病毒載體應用于哺乳動物細胞的表達在近幾年頗受重視，這是因為它與其它病毒載體相比有特有優(yōu)勢，如可通過昆蟲細胞大量制備病毒顆粒；可感染多種哺乳動物細胞，但在細胞內(nèi)無復制能力，生物安全度高；可插入高達38 kb的外源基因等。質(zhì)粒載體則是借助于物理或化學的作用導人細胞內(nèi)。依據(jù)質(zhì)粒在宿主細胞

15、內(nèi)是否具有自我復制能力，可將質(zhì)粒載體分為整合型和附加體型載體兩類。整合型載體無復制能力，需整合于宿主細胞染色體內(nèi)方能穩(wěn)定存在，如SV40病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體和游離型如痘苗病毒、腺病毒載體。利用 Sindbis virus(SV)、Scmliki Forest virus(sFV) 和痘苗病毒載體感染哺乳動物細胞表達的蛋白在結(jié)構(gòu)與功能上與天然哺乳動物來源的蛋白更相似。Liljestrom等利用SFV病毒載體感染哺乳動物細胞獲得的外源蛋

16、白占細胞總蛋白的；而附加體型載體則是在細胞內(nèi)以染色體外可自我復制的附加體形式存在。整合型載體一般是隨機整合入染色體，其外源基因的表達受插入位點 的影響，同時還可能會改變宿主細胞的生長特性。相比之下，附加體型載體不存在這方面的 問題，但載體DNA在復制中容易發(fā)生突變或重排。,轉(zhuǎn)基因植物表達系統(tǒng),自從20世紀80年代初利用植物基因工程技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因植物以來，植物生物技術(shù)得到了快速發(fā)展。伴隨著植物生物技術(shù)發(fā)展，植物體作為生物反應器正在成為外源

17、基因表達的重要體系，利用植物外源重組蛋白生成藥用蛋白或疫苗是轉(zhuǎn)基因植物研究的一個焦點。,轉(zhuǎn)基因植物表達重組蛋白的一般步驟,1、基因的克隆 2、轉(zhuǎn)化 3、表達 轉(zhuǎn)基因植物表達系統(tǒng)的分類1、穩(wěn)定的整合表達系統(tǒng)2、瞬時表達系統(tǒng)3、葉綠體轉(zhuǎn)化植物,具有直接使用可食性植物原料的可能性植物是一個能進行大規(guī)模生產(chǎn)的廉價生產(chǎn)系統(tǒng)，在獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株后，擴大耕種面積就能提高蛋白的產(chǎn)量，隨著種植面積的增加，產(chǎn)量可按比例快速增加。植物

18、具有完整的真核細胞表達系統(tǒng)，可加工多聚體蛋白因為植物不充當人類病原體的宿主，因此更具安全性,轉(zhuǎn)基因植物表達重組蛋白的優(yōu)點,轉(zhuǎn)基因動物表達系統(tǒng),將外源重組基因轉(zhuǎn)染并整合到動物受體細胞基因組中，從而形成在體表達外源基因的動物，稱為轉(zhuǎn)基因動物。轉(zhuǎn)基因動物表達系統(tǒng)，包括外源基因、表達載體和受體細胞等，基因組的轉(zhuǎn)移則是細胞核移植和動物克隆技術(shù)，人工合成與設(shè)計基因、全基因乃至基因組的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是合成生物學。,轉(zhuǎn)基因動物的概念,轉(zhuǎn)基因動物是指將特定

19、的外源基因?qū)珓游锸芫鸦蚺咛?，使之穩(wěn)定整合于動物的染色體基因組并能遺傳給后代的一類動物。 　　轉(zhuǎn)基因動物所有的細胞均整合有外源基因，并具有將外源基因遺傳給子代的能力，若動物只有部分組織細胞整合有外源基因，則稱為嵌合體動物，這類動物只有在整合了外源基因的“部分組織細胞”恰為生殖細胞時，才能將其攜帶的外源基因遺傳給子代。,轉(zhuǎn)基因動物表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點,1．轉(zhuǎn)基因動物成功率低 陽性率結(jié)果重復性差，甚至無法重復，轉(zhuǎn)基因動物的成功率較低。隨后的

20、研究雖然使成功率有所提高，但總的成功率還是較低，限制了其應用的發(fā)展。建立更完善的轉(zhuǎn)基因方法。使用大的外源DNA片段。 2．造成宿主基因突變問題 外源基因在動物基因組中的隨機整合，可能會引起宿主細胞基因的插入突變、缺失突變及宿主基因的擴增重排和移位，也可能激活正常狀態(tài)下處于關(guān)閉狀態(tài)的基因，從而導致動物表型的改變甚至造成動物不育或死亡?；虼虬屑夹g(shù)（gene targeting）能夠使目的基因定點整合，因此避免了對宿主基因的損傷，提高了陽性

21、率。 3．外源基因表達水平不高 轉(zhuǎn)入的外源目的基因在轉(zhuǎn)基因動物中是否高效表達是轉(zhuǎn)基因動物研究成敗的關(guān)鍵。對外源基因的整合機理進行深入研究。選擇表達效率高的啟動子。,4．安全性問題 插入的外源基因是否會影響宿主動物自身的基因表達及表達水平；轉(zhuǎn)基因動物是否可能會把外源基因傳遞給生活在其周圍的其它種群及環(huán)境，造成基因污染；在病毒等致病基因的轉(zhuǎn)基因研究中，不可避免地會產(chǎn)生一些有害的轉(zhuǎn)基因動物，是否可能因為使用轉(zhuǎn)基因動物制品而將一些動物性疾病傳遞

22、給人類。 將編碼活性蛋白的基因?qū)雱游锏氖芫鸦蛟缙谂咛?nèi)以制備轉(zhuǎn)基因動物，并使外源基因在動物體內(nèi) (乳汁、血液等 )高效表達，然后再分離提取目的基因編碼產(chǎn)物。動物就像一個活的發(fā)酵罐。其溫度、氣體、水分和pH值均由動物自身調(diào)節(jié)。所以有人把它喻為藥物工廠、生物反應器、基因農(nóng)場或分子農(nóng)場（molecular farming）。 轉(zhuǎn)基因動物作為生物反應器，其特點有：表達產(chǎn)物能充分修飾且具有穩(wěn)定的生物活性，產(chǎn)品成本低，并可進行大規(guī)模的生產(chǎn)；產(chǎn)品