基因工程期末復(fù)習(xí)

1、基因工程第一章：1.基因工程：在分子水平上進行的遺傳操作，指將一種或多種生物體的基因或基因組提取出來，或者人工合成的基因，按照人們的愿望進行嚴密的設(shè)計，經(jīng)過體外加工重組，轉(zhuǎn)移到另一種生物體的細胞內(nèi)，使之能在受體細胞遺傳并獲得新的遺傳性狀的技術(shù)。供體、受體、載體是重組DNA技術(shù)的三大基本元件。(工具酶也是必備元件)基本用途：大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質(zhì)，設(shè)計、構(gòu)建生物的新性狀甚至新物種。2.基因工程研究的主要內(nèi)容：目的基因的分離與制備，基因工程

2、研究的主要內(nèi)容：目的基因的分離與制備，DNA片段和載體的連接，外源片段和載體的連接，外源DNA片段引入受體細胞，選擇目的基因，目的基因表達。片段引入受體細胞，選擇目的基因，目的基因表達。3.基因工程的意義：大規(guī)模生產(chǎn)生物分子，設(shè)計構(gòu)建新物種，搜尋、分離和鑒定生物體?；蚬こ痰囊饬x：大規(guī)模生產(chǎn)生物分子，設(shè)計構(gòu)建新物種，搜尋、分離和鑒定生物體。發(fā)展前景：農(nóng)林牧漁業(yè)中的應(yīng)用，工業(yè)中的應(yīng)用，在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。發(fā)展前景：農(nóng)林牧漁業(yè)中的應(yīng)用，工業(yè)中的

3、應(yīng)用，在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。第二章：（結(jié)合課本劃線內(nèi)容）第二章：（結(jié)合課本劃線內(nèi)容）1.限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能：識別雙鏈限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能：識別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈，主要存在于原核細菌中，幫助細菌限制外來雙鏈，主要存在于原核細菌中，幫助細菌限制外來DNA的入侵；（發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象：寄的入侵；（發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象：寄主細胞的限制和修飾作用。主細胞的限制和修飾作用。）hsdR：編碼限制

4、性核酸內(nèi)切酶，：編碼限制性核酸內(nèi)切酶，hsdM：編碼限制性甲基化：編碼限制性甲基化酶，酶，hsdS：編碼限制性酶和甲基化酶的協(xié)同表達。：編碼限制性酶和甲基化酶的協(xié)同表達。（限制核酸內(nèi)切酶類型：（限制核酸內(nèi)切酶類型：I型，型，II型，型，III型；）型；）2.屬名屬名種名種名株名株名Haemophilusinfluenzaed嗜血流感桿菌嗜血流感桿菌d株先后分離出先后分離出3種限種限制酶：制酶：HindIHindIIHindIII，EcI

5、在抗藥性在抗藥性R質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)的第一個酶。質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)的第一個酶。同尾酶：識別不同的序列，能產(chǎn)生相同的黏性末端的酶；同位酶：不同微生物來源的酶，同尾酶：識別不同的序列，能產(chǎn)生相同的黏性末端的酶；同位酶：不同微生物來源的酶，能識別相同的序列，切割方式相同或不相同。能識別相同的序列，切割方式相同或不相同。3.II型限制性核酸內(nèi)切酶的切割方式：在識別序列的對稱軸上同時切割形成平末端如型限制性核酸內(nèi)切酶的切割方式：在識別序列的對稱軸上同時切割形成平

6、末端如EcV在識別序列的雙側(cè)末端進行切割，若于對稱軸在識別序列的雙側(cè)末端進行切割，若于對稱軸5‘端突出的末端如‘端突出的末端如EcI反之產(chǎn)生反之產(chǎn)生3’端突出的末端如端突出的末端如PstI。限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)的注意事項：限制性核酸內(nèi)切酶為濃縮酶；濃縮的酶液要用核酸內(nèi)限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)的注意事項：限制性核酸內(nèi)切酶為濃縮酶；濃縮的酶液要用核酸內(nèi)切酶緩沖液稀釋，切酶緩沖液稀釋，（不能用水稀釋，以免酶變性）（不能用水稀釋，以免酶變性）；核酸

7、內(nèi)切酶在含有；核酸內(nèi)切酶在含有50%甘油的緩沖液甘油的緩沖液中，于中，于20度穩(wěn)定保存；反應(yīng)中盡可能少加水，使反應(yīng)體積減到最小；延長反應(yīng)時間，使度穩(wěn)定保存；反應(yīng)中盡可能少加水，使反應(yīng)體積減到最小；延長反應(yīng)時間，使所需酶量減少。所需酶量減少。影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素：影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素：DNA樣品的純度；樣品的純度；DNA樣品的甲基化程度；核酸內(nèi)樣品的甲基化程度；核酸內(nèi)切酶的緩沖液性質(zhì)；切酶的緩沖液性質(zhì)；4.DNA連接酶

8、基本性質(zhì)：修復(fù)雙鏈連接酶基本性質(zhì)：修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵；修復(fù)與上缺口處的磷酸二酯鍵；修復(fù)與RNA鏈結(jié)合的鏈結(jié)合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵；連接多個平頭雙鏈鏈上缺口處的磷酸二酯鍵；連接多個平頭雙鏈DNA分子。分子。（注意：（注意：DNA連接酶所連連接酶所連接的是接的是DNA分子上相鄰核苷酸之間的切口，即分子上相鄰核苷酸之間的切口，即Nick鏈接，不能鏈接兩條單鏈鏈接，不能鏈接兩條單鏈DNA或環(huán)或環(huán)化的單鏈化的單鏈DNA分

9、子。分子。）DNA連接酶的種類：連接酶的種類：T4噬菌體噬菌體DNA連接酶（最常連接酶（最常用）用）、大腸桿菌、大腸桿菌DNA連接酶（最常見）連接酶（最常見）、T4噬菌體噬菌體RNA連接酶。連接酶。5.DNA聚合酶：⑴大腸桿菌聚合酶：⑴大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I的基本性質(zhì)：的基本性質(zhì)：5‘→3‘的DNA聚合酶活性；聚合酶活性；5‘→3‘的核酸外切酶活性；的核酸外切酶活性；3‘→5‘的核酸外切酶活性。用途：主要用于雜交探針的制備。的核酸

10、外切酶活性。用途：主要用于雜交探針的制備。切口平移法是目前實驗室中最常用的一種脫氧核糖核酸探針標記法。切口平移法是目前實驗室中最常用的一種脫氧核糖核酸探針標記法。⑵Klenow酶的基本性質(zhì)：大腸桿菌酶的基本性質(zhì)：大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分端三分之二的大肽段，即為之二的大肽段，即為Klenow酶；酶；Klenow酶仍擁有酶仍擁有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和聚合酶活性和3‘→5

11、‘的核酸外切酶活性，但失去了酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性。的核酸外切酶活性。Klenow酶的基本用途：補平由核酸內(nèi)酶的基本用途：補平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的切酶產(chǎn)生的5‘粘性末端；粘性末端；DNA片段的同位素末端標記；片段的同位素末端標記；cDNA第二鏈的合成；雙脫氧末端第二鏈的合成；雙脫氧末端質(zhì)粒。質(zhì)粒。雖然帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息，但失去了控制細菌配對和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因，因雖然帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息，但失去

12、了控制細菌配對和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因，因此不能從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞。在天然條件下不能自己轉(zhuǎn)移到另一個細胞中。大部此不能從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞。在天然條件下不能自己轉(zhuǎn)移到另一個細胞中。大部分屬于松弛型質(zhì)粒，符合基因工程的安全要求。注：基因工程中所用的非接合型質(zhì)粒載體分屬于松弛型質(zhì)粒，符合基因工程的安全要求。注：基因工程中所用的非接合型質(zhì)粒載體缺乏轉(zhuǎn)移所必須的缺乏轉(zhuǎn)移所必須的mob基因，所以不能發(fā)生自我轉(zhuǎn)移?；?，所以不能發(fā)生自我轉(zhuǎn)

13、移。質(zhì)粒的復(fù)制類型：質(zhì)粒的復(fù)制類型：1.嚴緊型質(zhì)粒：拷貝數(shù)少，只有嚴緊型質(zhì)粒：拷貝數(shù)少，只有1—3份拷貝。份拷貝。2.松弛型質(zhì)粒：拷貝數(shù)松弛型質(zhì)粒：拷貝數(shù)多，有多，有10—60份拷貝。份拷貝。3理想質(zhì)粒載體的必備條件：常見可用于基因工程的天然質(zhì)粒有理想質(zhì)粒載體的必備條件：常見可用于基因工程的天然質(zhì)粒有pSC101、CoLEl。第一個。第一個用于基因克隆的天然質(zhì)粒是用于基因克隆的天然質(zhì)粒是pSC101，是一個嚴緊型質(zhì)粒，每個宿主細胞僅有，

14、是一個嚴緊型質(zhì)粒，每個宿主細胞僅有12個拷貝，個拷貝，具有多個限制性核酸內(nèi)切酶的單一酶切位點；另一個天然質(zhì)粒載體是具有多個限制性核酸內(nèi)切酶的單一酶切位點；另一個天然質(zhì)粒載體是CoLEl，它唯一單酶，它唯一單酶切位點切位點EcI位于大腸桿菌素位于大腸桿菌素EI的編碼基因內(nèi)。的編碼基因內(nèi)。質(zhì)粒載體必須具備的基本條件：（質(zhì)粒載體必須具備的基本條件：（1）具有復(fù)制起點；（）具有復(fù)制起點；（2）具有抗菌素抗性基因；（）具有抗菌素抗性基因；（3）若

15、）若干限制性內(nèi)切酶的單一位點；（干限制性內(nèi)切酶的單一位點；（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。多克隆位點：指載體上人工合成的含有緊密排列的多種限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點的多克隆位點：指載體上人工合成的含有緊密排列的多種限制性核酸內(nèi)切酶酶切位點的DNA片段。片段。抗菌素抗性抗菌素抗性:氨芐青霉素抗性氨芐青霉素抗性(殺死生長的細菌殺死生長的細菌)，卡那霉素抗性（殺死細菌），卡那霉素抗性（殺死細菌），四環(huán)素抗

16、性，四環(huán)素抗性(殺死生長的細菌殺死生長的細菌)，鏈霉素抗性（殺死細菌），鏈霉素抗性（殺死細菌），氯霉素抗性（殺死生長的細菌），氯霉素抗性（殺死生長的細菌）。3.重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體：（重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體：（1）pBR322：松弛型復(fù)制、氯霉素可擴增、拷貝數(shù)：松弛型復(fù)制、氯霉素可擴增、拷貝數(shù)50100cell、用于基因克隆。、用于基因克隆。（2）pUC1819：拷貝數(shù)：拷貝數(shù)20003000cell、裝有多克隆位點、裝有多克隆位點（

17、MCS）正選擇顏色標記正選擇顏色標記lacZ、用于基因克隆和測序。注：、用于基因克隆和測序。注：pUC7是最早構(gòu)建的一種是最早構(gòu)建的一種PUC質(zhì)粒載質(zhì)粒載體。體。pGEM3Z：多拷貝、裝有多克隆位點（：多拷貝、裝有多克隆位點（MCS）、正選擇顏色標記、正選擇顏色標記lacZ、用于外源基因的高、用于外源基因的高效表達。效表達?？寺≥d體：指專用于基因或克隆載體：指專用于基因或DNA片段無性繁殖的質(zhì)體載體。片段無性繁殖的質(zhì)體載體。（名詞解（名

18、詞解釋）釋）4.容菌周期（裂解周期）：感染細菌后立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白質(zhì)外殼，重新組裝成容菌周期（裂解周期）：感染細菌后立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白質(zhì)外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導(dǎo)致細菌細胞解體，釋放出大量子代噬菌體。容原性周期：感染細菌后，噬菌體顆粒，并導(dǎo)致細菌細胞解體，釋放出大量子代噬菌體。容原性周期：感染細菌后，將自己的將自己的DNA整合到細菌的染色體整合到細菌的染色體DNA中。形成這一過程稱為溶源化。中。形成這一過程稱為溶源

19、化。5.單鏈環(huán)狀單鏈環(huán)狀DNA的絲狀大腸桿菌噬菌體：的絲狀大腸桿菌噬菌體：M13、f1、fd噬菌體。噬菌體。特點：單鏈特點：單鏈DNA；復(fù)制型（；復(fù)制型（RF）是雙鏈環(huán)狀）是雙鏈環(huán)狀DNA；RFDNA和ssDNA都能轉(zhuǎn)染感受態(tài)都能轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌。并產(chǎn)生噬菌斑；不存在包裝限制；可產(chǎn)生大量的含有外源大腸桿菌。并產(chǎn)生噬菌斑；不存在包裝限制；可產(chǎn)生大量的含有外源DNA插入片插入片斷的單斷的單鏈分子，便于作探針或測序。鏈分子，便于作探針或測序

20、。（1）M13噬菌體基本特性：寄主；噬菌體基本特性：寄主；DNA長度：長度：6407bp；DNA提純：容易提??；沒有包提純：容易提??；沒有包裝限制。優(yōu)點：（裝限制。優(yōu)點：（1）有）有MCS，便于克隆不同的酶切片段（，便于克隆不同的酶切片段（2）Xgal顯色反應(yīng)，可供直接顯色反應(yīng)，可供直接選擇（選擇（3）無包裝限制，克隆能力大（）無包裝限制，克隆能力大（4）可以克隆雙鏈）可以克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈。缺點：分子中的每一條鏈。缺點：插

21、入外源插入外源DNA后，遺傳穩(wěn)定性顯著下降。后，遺傳穩(wěn)定性顯著下降。人工染色體：酵母人工染色體（人工染色體：酵母人工染色體（YAC）、細菌人工染色體（、細菌人工染色體（BAC）、P1派生人工染色體、派生人工染色體、哺乳動物人工染色體（哺乳動物人工染色體（MAC）。第四章第四章1.基因組基因組DNA提取方法：堿抽提法（最常用）提取方法：堿抽提法（最常用）、煮沸法、去污劑裂解法。、煮沸法、去污劑裂解法。堿抽提法提取質(zhì)粒堿抽提法提取質(zhì)粒DNA

22、原理：閉合環(huán)狀的質(zhì)粒原理：閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會分離，復(fù)性快，染色，在變性后不會分離，復(fù)性快，染色體線性體線性DNA和或有缺口的質(zhì)粒和或有缺口的質(zhì)粒DNA變性后雙鏈分離，難以復(fù)性而形成纏繞的結(jié)構(gòu)，與蛋變性后雙鏈分離，難以復(fù)性而形成纏繞的結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)白質(zhì)—SDS復(fù)合物結(jié)合在一起，在離心的時候沉淀下去。復(fù)合物結(jié)合在一起，在離心的時候沉淀下去。堿抽提法提取質(zhì)粒堿抽提法提取質(zhì)粒DNA的步驟：溶菌；破膜，蛋白質(zhì)和的步驟：溶菌；破膜，